APL由癌蛋白PML-RARα驱动，招募辅抑制因子复合物，包括组蛋白去乙酰酶（HDACs），抑制细胞分化并促进APL启动。报道HDAC3在AML的APL亚型中高表达，HDAC3蛋白水平与PML-RARα呈正相关。在机制上，我们发现HDAC3在赖氨酸394处去乙酰化PML-RARα，降低了PIAS1介导的PML-RARα类泛素化修饰（SUMOylation）和随后RNF4诱导的泛素化。HDAC3抑制促进了PML-RARα的泛素化和降解，并降低了野生型和ATRA或ATO抗性APL细胞中PML-RARα的表达。此外，HDAC3的遗传抑制诱导了APL细胞的分化、凋亡和细胞自我更新的减少，我们证明了HDAC3抑制剂或ATRA/ATO联合可减少APL进展。总之，我们的研究通过去乙酰化PML-RARα确定了HDAC3作为PML-RARα癌蛋白的阳性调节因子的作用，并表明靶向HDAC3可能是研究APL的一种有前途的策略。
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RGFP966（Abmole，M2977，纯度为100%）是一种HDAC抑制剂，作用于HDAC3的IC50为0.08μM，比作用于其他HDAC选择性高200倍以上。
ATRA（Abmole，M5927，纯度>99%）是维生素A的代谢产物，在细胞生长，分化和器官发生中起重要作用。是RAR核受体的天然激动剂，对RARα/β/γ的IC50为14 nM。与PPARβ/δ结合的Kd值为17 nM。可以通过激活视黄酸受体抑制转录因子Nrf2。
FK228（Abmole，M2007，纯度>99%）是一种HDAC1和HDAC2抑制剂，IC50分别为36 nM和47 nM。
Bortezomib（Abmole，M1686，纯度>99%）是一种有效的蛋白酶体（proteasome）抑制剂，Ki为0.6 nM。Bortezomib可以抑制NLRP1的活化。
为了确定HDAC1、HDAC2和HDAC3在不同亚型中的作用，从GSE13204的转录数据集中研究基因表达的变化。HDAC3在易位t（15:17）、inv（16）/t（16:16）或t（11q23）/MLL的AML中表达高（图1A）。
此外，我们观察到，在mRNA水平上，与初始期APL相比，反复APL中HDAC2和HDAC3的表达更高，HDAC1的表达更低（图1C）。综上所示，这些数据表明HDAC3可能在PML-RARα驱动的APL中发挥重要作用。
进一步探讨了单独抑制HDAC1和HDAC2或HDAC3在原代hAPL细胞或NB4细胞系中的作用。HDAC1和HDAC2抑制剂FK228或HDAC3抑制剂RGFP966用于处理这些APL细胞。在原代hAPL细胞中，FK228抑制HDAC1和HDAC2可诱导细胞凋亡，但不诱导细胞分化，RGFP966抑制HDAC3可同时诱导细胞凋亡和分化（图1G, H）。此外，cleaved caspase 3的表达是通过抑制HDAC3而非HDAC1或HDAC2诱导的（图1I）。FK228处理并未对细胞分化率产生显著变化。而RGFP966处理对APL细胞分化有显著影响，并在NB4细胞中与ATRA产生诱导细胞分化的协同作用（图1J）。
同样，FK228处理NB4细胞的凋亡百分比高于对照剂组，但RGFP966处理后凋亡细胞的百分比远高于FK228处理后，且只有RGFP966与ATRA产生协同作用（图1K）。同时，RGFP966处理NB4细胞的cleaved caspase 3水平显著高于FK228处理（图1L）。在ATRA处理前后，HDAC3敲除均能促进NB4细胞的分化和凋亡（图1M-O）。这些数据表明，通过诱导APL细胞分化和凋亡，靶向HDAC3而非HDAC1或HDAC2是一种更有效的策略。
为了研究HDAC3抑制在体内对APL细胞的影响，将hMRP8PML-RARα小鼠的APL细胞移植到正常FVB小鼠（图2A）。3周后，RGFP966延长了APL小鼠的生存时间。RGFP966组小鼠的脾脏尺寸小于对照组小鼠。与ATRA组相比，RGFP966联合ATRA组小鼠的脾脏重量进一步降低（图2C）。流式细胞仪分析显示，与对照组相比，RGFP966组和ATRA组骨髓、脾脏和外周血中CD11b阳性（CD11b+）APL细胞增多。此外，RGFP966联合ATRA导致CD11b+APL细胞的比例更高（图2E-G）。
此外，利用APL异种移植小鼠模型验证HDAC3抑制的效果。将GFP慢病毒转导的hAPL NB4细胞静脉移植到NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Sug/JicCrl（NOG）小鼠（图2K）中，检测APL小鼠骨髓中APL细胞的分化和凋亡。HDAC3抑制和/或ATRA诱导抗白血病作用，脾脏大小减小，细胞分化增加，APL细胞浸润减少，CD11b阳性细胞和凋亡细胞增加（图2L-O）。
综上所示，这些结果表明HDAC3可能是APL的一个新靶点，抑制HDAC3可促进APL细胞的凋亡和增殖，从而缓解体内APL。
先前的研究表明PML-RARα降解恢复了PML核体（PML-NBs）的形成，因此我们接下来研究HDAC3是否可以调节PML-NBs的组装。如图3G所示，RGFP966处理增加了NB4细胞中PML-NBs的数量。此外，RGFP966诱导NB4细胞促分化。然而，硼替佐米对泛素蛋白酶体系统的抑制挽救了RGFP966引起的促分化作用（图3H）。
与对照细胞相比，RGFP966处理的NB4细胞中线粒体膜电位较低，这意味着细胞发生了早期凋亡（图3I）。此外，线粒体动力学实验表明HDAC3抑制促进了线粒体裂变。我们还发现APL细胞中PMLRARα与HDAC3共位点（图3J）。HDAC3过表达抑制PML-RARα的泛素化（图3K），而抑制HDAC3导致NB4细胞中PML-RARα的泛素化增强（图3L）。此外，HDAC3过表达也降低了PML-RARα的SUMOylation（图3M）。这些数据表明HDAC3通过干扰PML-RARα的泛素化来维持其稳定性。
我们的结果表明，HDAC3对PML-RARα的脱乙酰位点与ATO或ATRA对PML-RARα的结合位点不同。此外，通过逐渐增加As2O3剂量从0.1到1.5μM, NB4细胞系可获得耐ATO的NB4细胞亚系（图5H）。NB4-asr细胞对As2O3处理的敏感性较低。而RGFP966抑制HDAC3会降低NB4-AsR细胞的生长（图5H），并诱导NB4-AsR细胞分化和凋亡（图5I, J）。耐ATO形式的PML-RARα（A216V和L218P）对ATO诱导的降解具有抗性。我们发现RGFP966还有效地降低了A216V和L218P突变体以及抗ATRA突变体PML-RARα（ΔF286和R276Q）的蛋白水平（图5K）。
鸣谢：Bo Dai, et al. Cell Death Differ. 2023 Mar 9.
