文|面包夹知识

编辑|面包夹知识

«——【·前言·】——»

集约化水产养殖通常使用化学物质和抗生素防控细菌、真菌、病毒和寄生虫等引起的疾病。但抗生素导致的食品安全问题愈发严重。

因此寻找安全有效的抗生素替代品对于水产养殖的可持续发展非常重要。

益生菌具有安全、有效、无残留、无污染等优点，芽孢杆菌、乳球菌、酵母菌、肠球菌和乳杆菌属等益生菌，能够通过体内定植影响水产动物肠道微生物群落结构。

改善消化吸收与代谢功能，提升免疫水平与预防疾病，进而促进鱼虾生长，保障水产动物健康养殖。

不过，北京一科学研究基地发现，乳酸杆菌（Lactobacillus）可改善肠道微生态环境，增强肠道上皮细胞的屏障层功能，提高动物的免疫功能等，在动物生产中发挥益生素的作用。

在饲料中添加单一乳酸杆菌或含有乳酸杆菌的益生元可提高水产动物成活率，促进其生长，增加肠道有益菌数量。

红螯螯虾隶属十足目、拟螯虾科、滑螯虾属，具有食性杂、生长快、高产、环境耐受性广、肉质细嫩、味道鲜美、出肉率高及观赏性强等优点。

以红螯螯虾为研究对象，探究饲料中添加乳酸杆菌对其生长性能和肠道微生物群落结构的影响，为红螯螯虾的健康养殖提供参考。

«——【·材料与方法·】——»

乳酸杆菌是经过筛选保留下来的菌种（活菌数为1.8×109CFU/mL）。在营养肉汤（NB）培养基、营养琼脂（NA）培养基中进行菌种活化、扩培，得到活性菌种，用于后续试验。

红螯螯虾为实验室自繁虾苗。选取600尾健康无病、初重（0.55±0.05）g的虾苗，随机分为4组，每组3个重复，每个重复50尾虾苗。

基础饲料为上海红马饲料有限公司生产的淡水小龙虾配合饲料，营养水平为粗蛋白32%、粗脂肪5%、赖氨酸1.3%、总磷1.0%。

将活菌数为1.8×107CFU/mL的PBS乳酸杆菌菌液添加到红螯螯虾基础饲料中，添加量分别为0（CA组）、1.8×105（TB组）、1.8×106（TC组）、1.8×107CFU/g（TD组），试验期45d。

养殖试验，在日照职业技术学院水生物养殖实训中心，循环水系统中进行。

每个养殖缸为1个重复，养殖缸内放置遮蔽物，养殖用水为曝气自来水，水温25~26℃，溶解氧大于5mg/L，每天投饲2次（7：00、17：00），投饲30min后，虹吸出粪便和残饵。每天观察虾的生长情况、健康状态及蜕壳情况等。

PCR产物使用浓度为2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用1×TAE浓度2%的琼脂糖胶电泳回收PCR产物，利用GeneJET胶回收试剂盒进行纯化。

对IlluminaNovaSeq测序得到的下机数据（RawPE）进行拼接和质控，得到Cleanags，再进行嵌合体过滤，得到有效数据，用于后续分析。

试验数据采用SPSS21.统计分析程序软件进行分析，Duncan's 法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P<0.05表示差异显著。

«——【·结果与分析·】——»

乳酸杆菌对红螯螯虾生长性能和饲料效率的影响由表1可知，红螯螯虾成活率为83.33%~85.33%。

TB组和TC组红螯螯虾的末重、增重率和特定生长率显著高于CA组（P<0.05），TC组红螯螯虾的饲料系数显著低于CA组（P<0.05）。

与TC组相比，TD组红螯螯虾的生长性能未得到进一步改善。

基于IlluminaNova测序系统及数据分析，平均每个样本测得82540条tags，质量检测后平均得到76811条有效数据，有效数据总数超过51646条，质控有效率超过67.24%。

通过排序后在数据库上完成物种注释。在所有注释结果中，共有1166个OTU注释到种属水平，基于Chao1指数创建样品稀释曲线，结果见图1。

由图1可知，随着测序数量的持续增加，各采样曲线都达到平台期，表明测序深度基本能够涵盖全部试验样本的所有微生物种类。

各个样本测序的平均覆盖度均在0.996以上，也表明测序基本包含了试验样本中的全部微生物种类。

由图2可知，试验第15d，TB组、TC组的Shannon、Simpson指数均大于CA组，即TB组和TC组肠道菌群数量及物种多样性的均匀性均明显优于 CA 组。

试验第45d，各试验组的Shannon、Simpson指数均大于CA组，即试验组的生物多样性和均匀度明显优于CA组。

由图3可知，红螯螯虾的肠道主要功能菌由放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门组成。

变形菌门几乎在所有组中占据优势地位，其次是厚壁菌门。由图4可知，红螯螯虾肠道优势菌科主要是红杆菌科（Rhodobacteraceae）和气单胞菌科（Aeromonadaceae）。

由图5可知，红螯螯虾肠道优势菌属为副球菌属（Paracoccus）和气单胞菌属（Aeromonas）。

在门水平上，与CA组相比，TB和TC组放线菌门（Actinobacteriota）的相对丰度明显升高，TD组放线菌门相对丰度也升高。

在科水平上，与CA组相比，试验组红杆菌科的相对丰度均升高，气单胞菌科（Aeromonadaceae）的相对丰度均降低。

在属水平上，与CA组相比，试验组副球菌属（Paracoccus）的相对丰度均升高，气单菌属（Aeromonas）的相对丰度均降低。

与CA组相比，TC组气单胞菌科的相对丰度升高，TB和TD组气单胞菌科的相对丰度降低。

在属水平上，与CA组相比，TB和TC组副球菌相对丰度降低，TD组副球菌属相对丰度升高，与CA组相比，TB和TD组气单胞菌属的相对丰度降低，而TC组气单胞菌属的相对丰度升高。

在门水平上，与CA组相比，TB组与TC组放线菌门的相对丰度降低，TD组放线菌门的相对丰度升高，TC组和TD组拟杆菌门相对丰度升高，试验组的变形菌门相对丰度均升高。

在科水平上，与CA组相比，TB组红杆菌科的相对丰度降低，TC组和TD组红杆菌科的相对丰度升高。

与CA组相比，试验组气单胞菌科的相对丰度均升高。在属水平上，与CA组相比，TB组副球菌属的相对丰度显著降低。

TC组、TD组副球菌属的相对丰度升高，TB组气单胞菌属的相对丰度升高，TC组、TD组气单胞菌属的相对丰度明显升高。

«——【·讨论·】——»

乳酸杆菌对红螯螯虾生长性能和饲料效率的影响益生菌能够通过改变宿主或环境微生物群落、提高饲料营养价值。

增强宿主对疾病的反应或改善养殖环境等路径对宿主产生有益影响。生长性能是评价益生菌效果的主要指标之一。

乳酸菌可以显著改善罗非鱼、黑鲷、建鲤、细鳞鲑和大口黑鲈的生长性能，提高饲料利用率，增强抗氧化和免疫力，改善肠道健康。

本试验中，饲料添加1.8×106CFU/g乳杆菌可以显著提高红螯螯虾的末重、增重率和特定生长率，降低饲料系数。

有研究表明，饲料添加1.5×107CFU/g乳酸乳球菌显著提高了红螯螯虾的生长性能和肝胰腺组织消化酶活性。

研究表明，饲料中分别添加0.5%植物乳酸杆菌和1.0×1010CFU/kg不同乳酸菌均可促进凡纳滨对虾的生长。

乳酸杆菌对生长的益生作用可解释为产生水解酶（包括淀酵酶和蛋白酶）和维生素（如VB12）、消除饲料中有害物质的影响、刺激消化酶分泌、维持肠道菌群，从而改善营养吸收和促生长。

乳酸杆菌对红螯螯虾肠道微生物多样性的影响肠道菌群对动物的生长发育、消化、免疫力等均具有重要影响，通常被作为水生动物健康状况的综合指标。

鱼虾类肠道微生物的组成受到发育阶段、水环境、饵料成分及投喂策略等多种因素的影响，菌群结构的改变会间接影响鱼虾健康。

根据实验科学家发现，饲料中添加乳酸杆菌明显改变了红螯螯虾肠道的菌群结构，添加1.8×105CFU/g和1.8×107CFU/g乳酸杆菌时，红螯螯虾的肠道菌群多样性和丰度均升高。

也有研究表明：饲料中添加1.0×1010CFU/kg的嗜酸乳杆菌、粪肠球菌和凝结芽孢杆菌均明显改善了凡纳滨对虾肠道微生物群落的组成和丰度。

在门水平上，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为对虾肠道优势菌群；在纲水平上，α-变形菌纲、丹毒丝菌纲和黄杆菌纲为优势菌群。

池塘养殖中华绒螯蟹的肠道内益生菌定植较差，短期施用益生菌可以显著改变微生物群落β-多样性，促进肠道菌群的丁酸盐代谢。

枯草芽孢杆菌显著提高了牛蛙肠道菌群的丰度和多样性。

凡纳滨对虾肠道菌群中的核心菌门包括拟杆菌、变形杆菌、厚壁菌和放线杆菌，变形杆菌是对虾肠道的主要细菌。

饲料添加乳酸杆菌可以明显提高红螯螯虾消化道放线菌门、拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门等优势菌门的菌群相对丰度，其中变形菌门是肠道的主要菌群。

拟杆菌、厚壁菌和放线菌通过影响代谢活动的方式在维护宿主健康的生理学方面发挥重要作用，发酵宿主体内的不可消化碳水化合物，产生短链脂肪酸。

放线杆菌是能够产生酚氧化酶的有益菌，酚氧化酶分泌抗菌、抗氧化剂以及黏蛋白，从而保护宿主的正常肠道机能。

饲料中添加植物乳杆菌养殖细鳞鲑，通过多样性分析发现，在门水平上，肠道菌群以变形菌门、厚壁菌门和蓝细菌门为主。

有研究发现，饲料中添加乳酸乳球菌可以显著提高红螯螯虾的肠道有益菌丰度，降低潜在致病菌的丰度。

例如，有研究发现，添加微生物制剂可以明显提高小龙虾肠道内细菌生物多样性和丰度，肠道优势菌群为变形菌门，厚壁菌门相对丰度由6.10%提高至14.21%，有害菌群弧菌属数量由10.11%降低至4.68%，肠道菌群趋向丰富和稳定。

另外，有研究在饲料中分别添加枯草芽孢杆菌、3%光合细菌、0.1%复合菌剂、乳球菌属也得到了类似的结果。

在饲料中添加乳酸杆菌可以改善红螯螯虾养殖过程中的健康状况，有利于生长发育。

饲料中添加乳酸杆菌后，在红螯螯虾肠道的定植微生物群中，隶属于α-变形菌纲的红杆菌科的丰度较大，而气单胞菌属的相对丰度均有所降低。

红杆菌科菌株能够产生聚羟基丁酸酯，对鱼虾的生长与发育具有潜在的促进作用，海洋玫瑰杆菌已经被作为有益菌用于水产养殖。

气单胞菌普遍存在于水生生物肠道中，是消化道细菌的正常组成成分，属于条件病原菌，在特定环境情况下可导致宿主感染，严重时导致宿主死亡。