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创伤和外科手术后伤口愈合不良是一个紧迫的全球性医疗问题，每年影响数百万人，给医护人员带来巨大挑战。这一问题的产生是由于对患者生活质量的不利影响、社会心理压力的增加以及长期临床伤口管理所带来的巨大经济负担。统计数据显示，美国有 650 万患者的伤口愈合不良，在所有伤口类型中，手术伤口的费用最高，占医疗保险总支出的很大一部分。处理伤口的主要目标包括尽快闭合伤口，并获得功能性和美观性兼具的疤痕。然而，在正常愈合过程中，炎症和缺氧会偏离其典型模式，从而引发异常伤口愈合，导致伤口延迟闭合、瘢痕疙瘩形成和增生性疤痕的发展。因此，有效控制缺氧和炎症对开发新一代先进伤口敷料至关重要。虽然从脂肪组织来源的干细胞中提取的外泌体有望通过携带治疗生长因子和微RNA加速伤口愈合，但由于缺氧诱导的内细胞循环被激活，细胞内货物的输送在缺氧组织中受到影响。
为应对这一挑战，来自美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的Joseph Irudayaraj团队开发了一种策略，将氧纳米气泡与外泌体包裹在一起，并将其纳入聚乙烯醇/明胶混合水凝胶中。这种方法不仅能缓解伤口缺氧，还能在缺氧条件下有效地输送外泌体包裹的纳米粒子。水凝胶的自愈合特性及其成分明胶有助于止血，而其交联键可促进过氧化氢分解，从而改善伤口炎症。本研究展示了这种多功能水凝胶在雄性大鼠全厚伤口模型中增强愈合、促进血管生成、促进外泌体输送、缓解缺氧和抑制炎症的潜力。相关工作以题为“Exosome-coated oxygen nanobubble-laden hydrogel augments intracellular delivery of exosomes for enhanced wound healing”的文章发表在2024年04月23日的国际顶级期刊《Nature Communications》。
1. 创新型研究内容
为进一步优化伤口敷料的止血和抗氧化性能，本研究将聚乙烯醇（PVA）、明胶（GA）和硼砂结合在一起，开发出了一种混合水凝胶。这种水凝胶通过化学硼酸酯键实现动态交联，使其具有优异的组织粘附性、自愈能力和形状适应性。PVA/GA 水凝胶具有自愈合能力的机制是硼酸交联。推测有两种可能的交联途径，即种内交联（PVA-PVA）和种间交联（PVA-GA）：(i) 硼酸酯；(ii) 离子交联（图 1a）。因此，它非常适合需要经常拉伸的伤口和身体经常运动的部位，并能通过有效密封伤口部位来保护伤口，降低进一步受伤或污染的风险。此外，水凝胶中的硼酸键具有与过氧化氢（H2O2）发生反应的独特能力，从而减轻过度炎症。此外，明胶因其止血特性而闻名，它的加入进一步增强了敷料促进血液凝结的能力（图 1b），有助于加速创伤和手术伤口的愈合。
图1 EBO 凝胶介导的伤口愈合示意图
【EBO 的合成与表征】
脂肪组织是应用于组织工程和干细胞治疗不可或缺的间充质干细胞储库，因为它可以通过微创手术方便地获取。本研究从人体脂肪组织中分离出 ADSCs，并着手提取和鉴定从这些 ADSCs 中提取的外泌体。分离出的 ADSCs 表现出与间充质干细胞常见的纺锤形特征和成纤维细胞样生长模式。此外，这些细胞显示间充质干细胞标志物（CD90、CD105和CD44）阳性表达，而CD106、CD45和CD19阴性表达。分离出的外泌体颗粒大小分布均匀，平均直径为125.2 nm，纳米颗粒追踪分析（NTA）测得其浓度为7.22 × 108个/mL（图2b）。外泌体的蛋白质浓度由双喹啉酸（BCA）蛋白质测定法定量。透射电子显微镜（TEM）成像显示，外泌体具有典型的圆形或杯状形态，直径约为 100 纳米（图 2e）。
图2 EBO 的合成与表征
【EBO 凝胶的特点】
PVA、明胶和 EBO 的水性混合物是一种低粘度液体，加入 2 wt%的硼砂后，瞬时交联迅速形成硼酸酯键，几秒钟内就形成了粘弹性水凝胶。图 3a、b显示了这些关键流变特征的证据。这些图像被称为原流变学，可用于定性和定量推断。例如，图3a中倾斜的EBO-凝胶小瓶证明其粘度很高，足以在5分钟的观测时间尺度上抑制流动，在约100帕的重力应力下，其隐含粘度约为η ~ 104Pa·s。在更高的外加应力下，EBO-凝胶很容易流动，如图 3b 所示，用手从注射器中挤出材料，其特征流动应力约为 100,000 Pa。由于材料在高应力下容易流动，但在较低应力下仍能保持形状（图 3b 中的 UIUC 形状），这证明了材料具有显著的剪切变薄特性。这种可注射的设计进一步促进了与缺陷形状的吻合，从而实现了精确和量身定制的应用。
SEM 图像显示了 EBO 凝胶的多孔结构和纳米级颗粒的存在（图 3i）。与 Blank 凝胶中观察到的光滑表面不同，EBO-凝胶的表面更粗糙，凝胶骨架上附着纳米级颗粒，表明存在 EBO。为确定水凝胶的形状适应性，对其进行了迭代重塑，反复将其重构为各种形态，包括星形、新月形、圆形和十字形，这表明 EBO-Gel 能够有效地适应不规则的伤口形状，从而突出了其在临床环境中的适应性（图 3c）。
图3 EBO 凝胶的特性
【氧气供应和 ROS 消除评估】
图 4b 显示了 EBO 凝胶和 ONB 凝胶与 Exo 凝胶和 Blank 凝胶相比在缺氧条件下的供氧能力。图 4b 显示了 EBO-Gel 和 ONB-Gel 与 Exo-Gel 和 Blank-Gel 相比在缺氧条件下的供氧能力。尽管 12 小时后氧气含量有所下降，但缺氧环境中的溶解氧在 40 小时后超过了 Control-Gel 中的溶解氧含量。这支持了随后的体内实验中每两天更换一次敷料以维持伤口床最佳氧含量的治疗方法。本研究使用[Ru(dpp)3]Cl2（RDPP）作为细胞缺氧指示剂，研究了人真皮成纤维细胞（HDF-a）的缺氧情况（图 4c）。值得注意的是，用EBO-凝胶和ONB-凝胶培养的细胞显示出较低的RDPP荧光强度，这表明缺氧得到了有效缓解，从而验证了EBO-凝胶卓越的细胞供氧能力。
图4 EBO 凝胶的供氧和抗氧化特性
【外泌体输送增强研究】
研究发现氧传感途径可调节内吞。以前的研究也表明，在缺氧组织中，外泌体的胞内货物运输会受到影响。因此，EBO有望通过提供氧气恢复外泌体在缺氧微环境中的输送效率。为了探究外泌体的递送效率，将HDF-a细胞与CFSE标记的外泌体共培养8小时，用免疫荧光评估外泌体与内溶酶体标记物Lamp2的共定位（图5a）。值得注意的是，在缺氧条件下，观察到外泌体和 Lamp2 的共定位明显减少，这表明外泌体向内溶酶体的转移减少，而内溶酶体通常是将蛋白质货物释放到细胞质中的场所（图 5b）。
已知缺氧会通过调节 Rab1119 影响内吞循环。因此，外泌体通过外泌作用进行再循环可能会阻碍其货物有效释放到细胞质中，从而影响治疗货物的递送。为证明这一假设，在不同的实验条件下，包括缺氧、常氧和使用增氧剂（EBO）处理（图 5c），CFSE 标记的 ADSC 衍生外泌体被内化 24 小时，然后评估随后在 12 小时间隔内重新分泌到培养基中的 CFSE 信号。结果表明，与 EBO 处理组和常氧组相比，缺氧培养期间外泌体蛋白在培养基中的回收率更高（图 5d）。这一观察结果表明，EBO处理有可能增强外泌体逃避缺氧引起的内细胞循环的能力，从而促进治疗货物在细胞胞质内的释放。
图5 增强细胞内外泌体输送
【生物相容性和止血效果评估】
为检测EBO-凝胶的生物相容性，进行了细胞毒性试验和溶血试验。在细胞毒性实验中，将 HDF-a 细胞与四种不同浓度的 Exo-凝胶、ONB-凝胶和 EBO-凝胶培养 24 小时。在溶血试验中，所有水凝胶组的溶血率均低于 2%（图 6b），表明它们具有良好的血液相容性。止血在伤口愈合的初始阶段起着关键作用，是建立临时屏障以保护下层组织免受额外伤害和潜在感染的关键步骤。鉴于手术伤口和外伤出血的频繁发生，先进的伤口敷料应具备加快止血过程的能力。明胶的成分与细胞外基质相似，能有效引发血小板聚集，促进止血，因此明胶已成为一种前景广阔的止血材料，备受关注。此外，PVA 水凝胶作为一种自愈合生物粘附性水凝胶，可无缝粘附在出血部位，形成物理密封，有效控制和管理出血过程（图 6c），是一种很有前景的栓塞止血剂。因此，本研究对 EBO 凝胶的止血功能进行了体外和体内评估。EBO-凝胶与大鼠全血和血细胞以2:1的体积比混合1分钟后，出现凝固现象。与对照组和非止血凝胶（Carbopol水凝胶组）相比，这表明其止血能力与CURAD® BloodStop® 止血纱布和BleedStop™等商业产品相似（图6d）。
图6 生物相容性和止血性能评估
【体外促进增殖、迁移和血管生成】
使用水凝胶处理后暴露于缺氧条件下 24 小时和 48 小时的 HDF-a 细胞评估了细胞增殖情况。如图 7b 和 c 所示，EBO-凝胶组的增殖细胞数量明显高于其他组。与其他组相比，EBO-Gel 组的 BrdU 阳性信号明显增加（图 7a），S/(G2/M)期细胞增多（图 7k），表明新合成的 DNA 增加，这证实了 EBO-Gel 促进细胞增殖的能力。
图7 评估细胞增殖、迁移和血管生成的增强情况
【体内伤口愈合分析】
EBO-凝胶具有强大的组织粘附性、氧气释放性、抗氧化性和增强的外泌体递送特性，所有这些特性都有望用于无创伤口闭合。因此，本研究在大鼠全厚缺损模型中对 EBO-Gel 的伤口愈合性能进行了评估。图 8a 描述了手术过程、敷料应用和愈合时间表。结果显示，与其他组相比，EBO-凝胶处理组的愈合速度明显加快，尤其是在第2天到第10天的增殖阶段（图8b-e）。值得注意的是，Tegaderm 组在第 2 天和第 4 天出现了感染和炎症迹象，而使用水凝胶敷料的组则没有出现明显的感染（图 8b）。在整个治疗过程中，观察到手术后最初两天体重有所下降，这可能是由于麻醉恢复所致。随后，动物体重逐渐增加，到第 14 天时体重有所增加（图 8f）。此外，经过14天的治疗，使用EBO-凝胶治疗的伤口显示出极佳的恢复质量，其特点是没有增生性疤痕和瘢痕疙瘩。
图8 EBO 凝胶在大鼠全厚伤口模型中的体内疗效
为全面评估不同治疗方法的疗效，在第 4 天和第 14 天采集的组织样本采用苏木精和伊红（H&E）染色法和马森氏三色染色法进行组织病理学评估，重点是皮肤修复参数，包括疤痕指数、真皮厚度、表皮厚度和胶原部分。第 4 天是愈合过程中炎症和增殖阶段的关键时间窗口，而第 14 天可反映再生阶段和愈合效果。本研究发现：EBO-凝胶组表现出表皮持续再生、成纤维细胞增殖增加、血管生成增强和胶原纤维形成。相比之下，Tegaderm 组和 Blank-Gel 组的伤口闭合不全，炎症浸润面积较大。这凸显了 EBO 凝胶在影响伤口愈合的炎症、增殖和早期再生阶段的作用。染色结果表明，在第 14 天，所有治疗组的伤口都明显闭合，并有新形成的表皮（图 9a、b）。
代表疤痕大小的疤痕指数（SI）是用疤痕面积（平方毫米）除以相应的真皮平均厚度（毫米）得出的。计算结果表明，使用EBO-凝胶治疗的一组疤痕指数最低，表明愈合效果较好（图9c）。伤口完全愈合的标志还包括真皮层的修复。真皮层厚度测量结果显示，使用EBO-凝胶治疗的一组真皮层较厚，表明愈合过程更稳健，组织修复良好（图9d）。相反，新形成的表皮厚度更接近正常皮肤组织，表明愈合反应更加均衡（图 9f）。表皮变薄有利于防止形成厚痂或瘢痕疙瘩，否则会影响再生组织的正常功能。
图9 对使用不同水凝胶处理的伤口进行组织学分析
2. 总结与展望
总之，本研究最终开发出了一种混合水凝胶，它在止血、抗炎、缓解缺氧和增强外泌体递送方面具有卓越的能力，将其应用于全厚伤口时，可加快愈合速度并显著改善愈合质量。值得注意的是，EBO-凝胶还可用于糖尿病慢性伤口的治疗，利用其供氧能力、抗氧化特性、促进细胞迁移和增强血管化。未来的研究还可以针对其他缺血性疾病，包括慢性伤口和潜在的癌症。
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