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骨替代材料的使用对于大面积骨缺损的愈合至关重要。骨替代材料诱导的免疫反应在骨再生中至关重要。以往的研究主要集中在先天免疫细胞上，如巨噬细胞。现有研究表明，T淋巴细胞作为适应性免疫细胞，在骨再生中起着不可或缺的作用。然而，控制T细胞募集和对骨再生至关重要的特定亚群的机制仍不清楚。
近期，武汉大学口腔医学院的王敏和夏海斌团队证明双相磷酸钙（BCP）激活巨噬细胞中的钙通道导致它们释放趋化因子Ccl3和Ccl17以募集CD4+ T细胞，主要是调节性T细胞（Tregs），它们在BCP的异位成骨中起着至关重要的作用。
相关研究成果以“Biphasic calcium phosphate recruits Tregs to promote bone regeneration”为题于2024年1月6日发表在《Acta Biomaterialia》上。
1. 巨噬细胞募集的CD4+ T细胞在BCP诱导的异位骨化中起着至关重要的作用
植入生物材料后CD4+ T细胞的出现可能与巨噬细胞释放特定的趋化因子有关(图1A)。BCP周围组织的IF染色表明巨噬细胞的去除减少了CD4+ T细胞的募集(图1B)。使用磁珠分离小鼠脾脏CD4+ T细胞，并在不同培养基中体外培养，结果进一步表明可以通过BCP促进CD4+ T细胞的募集(图1C)。而后，研究者将BCP材料植入腓肠肌，组织学染色结果显示，在CD4+ T-del组中，手术后8周没有新骨形成(图1D，E)；免疫组织化学结果证明，CD4+T-del组中成骨细胞标记物(Col1a1和Runx2)的表达减少(图1F，G)。
图1 CD4+ T细胞对巨噬细胞的趋化对BCP的异位骨化至关重要
2. BCP通过激活巨噬细胞中的钙通道释放Ccl2、Ccl3和Ccl17诱导CD4+ T细胞的趋化性
研究者制备了BCP提取物，以深入了解巨噬细胞释放趋化因子的机制。IF染色结果显示，用BCP提取物刺激后，RAW264.7中的游离细胞质Ca2+浓度显著增加(图2A)。流式细胞仪结果证实了在加入BCP提取物后Ca2+快速流入RAW264.7(图2B)。最后，免疫印迹试验证明BCP提取物增强了ORAI1和STIM1(SOCE中的重要蛋白)和CaN蛋白(一种Ca2+依赖性信号分子)的表达(图2C)。
Luminex方法和Transwell迁移实验中，在BCP提取物组中，Ccl2、Ccl3和Ccl17基因表达上调，这表明BCP可能通过调节巨噬细胞释放Ccl2、Ccl3和Ccl17来诱导CD4+ T细胞趋化性(图2D,E)。
图2 BCP通过激活巨噬细胞中的钙通道释放Ccl2、Ccl3和Ccl17诱导CD4+ T细胞的趋化性
3. 被巨噬细胞趋化移动的CD4+T细胞是Tregs
随后，研究者使用流式细胞仪检测了第7、14和21天BCP周围CD4+ T细胞亚型的变化(图3A)。Th1细胞在第7天达到最高表达，Th2细胞维持相对低的水平，而Treg水平显著上升。BCP及周边用IF染色的Tregs比例也显示出相同的趋势(图3B,3C)。
图3 巨噬细胞趋化性CD4+ T细胞为Tregs
4. 巨噬细胞衍生的Ccl3和Ccl17趋化Tregs促进成骨
基于以前的研究结果，研究者假设巨噬细胞衍生的趋化因子可以诱导Tregs的趋化作用。IF染色结果显示，在巨噬细胞耗尽后，BCP周围区域的细胞释放的Ccl3和Ccl17显著减少(图4A，C)。在PBS组的BCP邻近区域中Tregs的数量显示出显著的增加(图4B，C)。
接下来，研究者检测了巨噬细胞耗竭后的异位成骨。植入8周后，BCP周围组织的H&E和Masson染色显示巨噬细胞的减少，减少了异位骨化(图4D，E)。免疫组织化学染色显示，巨噬细胞的缺失显著增加了成骨细胞标记物(Col1a1和Runx2)的表达(图4F，G)。
图4 巨噬细胞衍生的Ccl3和Ccl17趋化Tregs促进成骨
5. Tregs在BCP异位成骨中起重要作用
为了验证Tregs在异位成骨中的重要作用，研究者通过在BCP植入前一天和植入后每两天给Foxp3-DTR小鼠注射DT来去除Tregs(图5A)。流式细胞术证明了Tregs的去除效率(图5B，C)。植入8周后，使用H&E和Masson染色对BCP周围的组织进行分析，发现Tregs的去除显著降低了异位骨化(图5D，E)。免疫组织化学染色显示，在存在Tregs的情况下，成骨细胞标记物(Col1a1和Runx2)的表达显著降低(图5F，G)。
图5 Tregs在BCP异位成骨中起重要作用
综上，本发现表明，BCP激活巨噬细胞中的钙信号通路，释放趋化因子Ccl3和Ccl17。这些趋化因子募集Tregs，Tregs在BCP介导的骨再生中至关重要。这项研究为骨替代材料和免疫系统之间的相互作用提供了有价值的见解，突出了这种相互作用在骨组织再生中的意义。
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