仅供医学专业人士阅读参考

点击右上方“关注”，准时接收每日精彩内容推送。

在探索生命科学的征途上，每一次技术的飞跃都为我们揭开了新的篇章。今天，我们将带您走进由动物丝蛋白驱动的3D体外模型世界，感受这一科技创新如何为生物医学研究带来的变革。

【2D细胞培养和实验动物模型的局限】

长久以来，2D细胞培养技术在生物医药研究中扮演着重要角色。然而，它们也存在一些局限性：无法完全捕捉到细胞间相互作用的复杂性以及细胞外基质（ECM）的细微差别，在模拟体内微环境中的行为和功能方面也受限，这限制了它们在研究体内组织发育、药物筛选和疾病发展等方面的应用。另一方面，动物模型虽然在生物医学研究中不可或缺，但也面临着成本、动物伦理、生物学差异等挑战。关于这些问题，一些国家的相关组织也在尝试进行变革。如美国食品和药物管理局（FDA）在2022年颁布的现代化法案2.0（FDA Modernization Act 2.0），旨在药物开发过程中，鼓励使用体外模型实验、计算机模拟等非动物实验方法，减少对模型动物的依赖。

【3D体外模型的崛起】

3D体外模型技术应时而生，成为研究组织发育、药物筛选和疾病建模的重要工具。它们提供了一个更加接近体内组织的微环境，能够准确模拟组织微观结构和生理特征。目前，已经开发了基于动物蛋白、ECM混合物和合成聚合物等生物大分子的各种3D体外模型，以满足不同的研究需求。

【蚕丝蛋白的神奇转变】

来自浙江大学的杨明英教授/帅亚俊副研究员团队联合香港中文大学的毛传斌教授团队，对动物丝蛋白的组成、结构、性质和功能进行了系统综述，并深入探讨了动物丝蛋白（主要为丝素蛋白，SF）基3D体外模型在生物医学应用中的创新进展，特别强调了SF基质在体外组织结构中独特的生理特性和重要性。最后，本综述总结了当前的研究挑战和未来的发展方向，为开发复杂的仿生丝蛋白基微组织/类器官提供了灵感。近期，相关工作以题为“Bioengineered Silk Protein-Based 3D in vitro Models for Tissue Engineering and Drug Development: From Silk Matrix Properties to Biomedical Applications”的文章发表在生物材料领域知名期刊《Advanced Healthcare Materials》。

01

研究梗概

蚕丝蛋白基 3D 体外模型 （S3DM）：

动物丝蛋白是一种天然的聚合物，不仅在纺织业中大放异彩，还扩展到组织工程、生物医学、食品保鲜、柔性电子和环境可持续性等领域。其中，SF作为动物丝蛋白中的佼佼者，因其结构和功能与胶原蛋白相似，在构建先进且高性能的 3D 体外模型以用于生物医药的研究和应用方面发挥着日益重要的作用。蚕丝蛋白3D体外模型具备多项优势，如良好的生物相容性、广泛的来源、可再生性、环境友好性、生物可降解性、可调的力学性能、易于加工、低免疫原性以及三维结构稳定性等。这些优势使得蚕丝蛋白成为构建3D体外模型的理想选择，尤其适用于需要模拟复杂生物环境和进行长期细胞研究的情形。丝蛋白还能够被加工成多种形式的3D结构，包括水凝胶、3D打印支架、微流控芯片、多孔支架、多孔微球、自组装基质等，以满足不同生物学研究和医学应用的具体需求（图1）。

图1 丝素的理化性质及其在3D体外模型中的应用 [1]

【丝素蛋白是3D细胞培养的理想基质】

a. SF来源于蚕丝的核心纤维，从宏观、微观、纳米及分子等尺度上呈现出多层次排列的精细结构。例如，通过适当方式剥离丝纤维，能够制备出平均直径约为1 µm的微丝纤维，而每根微丝纤维又由大约50~100根定向排列的原纤维组成，将原纤维解缠后可得到平均直径约为20 nm的纳米纤维，这些超细的蛋白纳米纤维能够模拟ECM的几何结构特征和组成成分，为干细胞的生长提供了仿生支撑。

b. SF溶液能够通过调节浓度、pH、添加有机溶剂、超声波处理、化学交联、施加剪切作用及与3D打印技术结合等方法，实现溶液-凝胶转化。这一凝胶化过程使SF成为细胞包封和3D细胞培养的理想选择。

c. SF具有良好的生物相容性、广泛的力学性能可调性、长期的降解稳定性以及灵活的可加工性。研究表明，修饰后的SF作为细胞生长的基质，能够招募细胞、促进细胞增殖，并维持细胞活力，是细胞相互作用和体外组织模型应用的理想基质。

【丝素模拟细胞基质微环境】

细胞外基质(ECM)是由细胞分泌的大分子构成的复杂三维框架，对组织成熟起着至关重要的作用。然而，体外2D培养的细胞常常缺乏天然ECM存在中的纳米纤维结构和蛋白成分。为克服这一限制，可以采用人工基质来复制ECM中的生化和物理信号。

Matrigel是一种常用于三维细胞培养的基质，来源于动物体内，含有层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、糖蛋白和生长因子等成分，但可能含有炎症因子、细胞因子和病菌物质，且来源多样，难以确定调控细胞命运的关键成分。相比之下，SF由于其极高的蛋白纯度（蛋白含量高达99%以上）和与天然ECM相似的功能，成为体外诱导ECM重塑的候选材料。多项研究表明，SF作为细胞生长的基质，能够促进细胞募集、增殖，并维持细胞活力；其SF基微组织等效物展现出均匀的细胞增殖和时空变化，表明在某些情况下，SF可以作为Matrigel的替代品。

构建精确的细胞-基质微环境至关重要。在天然ECM中，细胞与基质的相互作用包括生化信号和物理线索。SF基材料不仅可以提供生化线索以促进细胞增殖和分化，还能够整合多种生化信号，增强组织修复。此外，SF能够根据需求便捷地创制出多样的生物物理线索，包括微纳特征、各向异性结构和表面图案等。高孔隙率的多孔支架作为生物物理信号，不仅模仿了天然ECM，还通过相互连接的孔隙结构促进了细胞迁移（图2）。

图2 SF基生物材料体外重建ECM样结构 [2]

【S3DM的应用】

图3 S3DM的应用概述 [1]

a. 肠道类器官

肠道系统由复杂的中空结构组成，由于其拥有庞大的神经系统，‌成为人体“第二大脑”的重要构成部分，与脑肠轴密切相关。全球范围内，肠道疾病和功能障碍影响着数千万人，甚至自闭症和抑郁症等也与之相关。

S3DM技术通过模拟真实肠道环境，能够再生出具有紧密连接和微绒毛极化特征的人类小肠类器官，有助于对炎症性肠病的研究以及对大肠杆菌感染免疫反应的探索。此外，3D肠道模型还被用于隐孢子虫感染的研究，为治疗方法的探寻提供了新的途径。

b. 皮肤组织模型

皮肤是人体的多功能屏障，对抵御外界威胁方面发挥着关键作用。皮肤组织模型的开发旨在解决实验动物使用所涉及的伦理问题。S3DM能够模拟人类皮肤的生理状态，涵盖表皮、真皮和其他皮下组织，有助于评估皮肤渗透性、研究伤口愈合和皮肤疾病的治疗，同时能够更直观地呈现经皮药物输送的效果和毒性评估。一些研究使用丝蛋白创建了全层皮肤等效模型，能够反映体内表皮和真皮的结构，保持了长期的结构稳定性，并表达关键的皮肤相关蛋白。研究还发现，使用丝蛋白与其它聚合物复合构建的模型能有效模拟皮肤免疫反应和修复过程。

c. 肝脏模型

肝脏是人体第二大且最重要的内脏器官，承担着众多关键功能。然而，脂肪肝、药物或酒精引起的肝损伤以及肝细胞癌等，都会严重影响肝细胞功能。为应对这些问题，研究人员开发了体外肝组织等效模型，以模拟肝脏的生理功能和病理状态，为严重肝病患者提供肝移植的替代方案。有研究表明，3%浓度的SF多孔支架能长期促进肝细胞生长并增加白蛋白的表达。与传统2D培养相比，3D支架还能刺激与肝细胞脂肪变性相关的基因表达。尽管如此，S3DM在复制肝细胞代谢异质性方面存在一定局限。为解决这一问题，另一项研究通过调整肝细胞外基质与SF的比例，培养了一种在灌注生物反应器中的体外肝系统，模拟了中心周向梯度效应和氧气梯度。

d. 心脏微组织

心脏疾病治疗是再生医学面临的重大挑战。研究显示，生物材料能促使成纤维细胞转化为心肌细胞，但效果依赖于其与外源性转录因子的相互作用。Hu等人发现SF基材料能直接转化心肌细胞，无需外部转录因子或药物，避免了免疫原性和不可控的分化问题，为体外起搏器模型提供了一种有前景的蛋白质基础。

3D生物打印技术使得直接制造具有精确解剖结构和生物模拟的S3DM成为可能。Mehrotra等人成功使用非桑蚕丝蛋白墨水打印出具有类似心脏组织机械韧性（约40 kPa）的S3DM，这种3D打印的心脏组织可能有助于个性化的药物筛选。

e. 泌尿系统模型

尿路系统包括肾脏、输尿管、膀胱和尿道，负责人体的多项关键生理功能。研究者致力于开发能够模拟过滤、吸收和分泌等基本功能的体外尿路系统模型。Szymkowiak等人制备了具有仿肾部管状结构的SF蛋白支架，促进了肾细胞的增殖和成熟。重要的是，关键标志物的均匀上调表达体现了肾脏功能，凸显了SF各向同性多孔材料在体外肾脏模型中的潜在应用。此外，研究人员利用3D胶原蛋白/SF多孔支架共培养细胞，成功构建了模拟常染色体显性多囊肾病的病理性肾脏模型，为药物筛选提供了新的体外平台。

f. 软骨和骨组织类器官

S3DM技术为软骨和骨组织损伤提供了一种颇具前景的临床解决方案，能够模拟成骨过程并评估骨髓间充质干细胞的成骨潜力。通过调整微环境因素，如机械强度和孔径，能够提高成骨分化效率。此外，共培养技术促进了软骨细胞与干细胞的相互作用，有助于软骨再生。创新的水凝胶微球技术为骨关节炎治疗提供了新策略，有望促进软骨再生和改进治疗方法（图4）。

图4 基于SF的类软骨器官用于骨关节炎治疗 [3]

g. 脑和神经系统模型

大脑是人体最为关键且神秘的组成部分之一，作为所有神经系统的中心枢纽，以其特异性和复杂结构而著称。S3DM作为模拟神经组织中的结构复杂性、微环境因素、细胞间相互作用和细胞-细胞外基质动态的有力工具，为我们深入了解大脑的复杂性提供了宝贵的视角 （图5）。与传统的2D培养不同，3D类脑组织结构能够在时空条件下自我组织，从而精准呈现大脑生理学中固有的复杂结构关系。值得注意的是，S3DM的多功能性在研究受损脑组织，包括创伤性脑损伤和帕金森病的多种表型表达方面也具有重要价值。

图5 利用具有纳米纤维和微层状结构的SF片层支架构建体外神经干细胞募集和分化的仿生体外3D模型 [4]

02

总结与展望

该综述广泛讨论了各类动物丝蛋白类型及其作为基质胶替代物的潜力，总结了构建S3DM的多种方法，综述了S3DM在模拟皮肤、骨骼、肠道、肝脏等多种器官方面的优势和应用。未来可以朝着提高微组织细胞密度、实现体外血管化培养、通过共培养细胞增强复杂性等方向深化S3DM的构建研究。

了解更多

关注“EngineeringForLife”，了解更多前沿科研资讯