仅供医学专业人士阅读参考
点击右上方“关注”，准时接收每日精彩内容推送。
细胞和细胞外基质（ECM）的各向异性组织对包括心肌在内的许多生物组织的生理功能至关重要。在心肌梗塞等疾病进展过程中，这种组织在空间和时间上会逐渐发生变化。机械刺激的作用已被证明是获得、维持和消除这种组织结构的关键，但其潜在机制却鲜为人知。因此，要研究其中的机械生物学机制，就必须采用能够时空控制多尺度组织机械环境的体外技术。
来自荷兰埃因霍芬理工大学的Ignasi Jorba和Carlijn VC Bouten团队利用光敏材料结合光照技术，制作了2D和3D体外模型系统，使细胞暴露于多尺度、时空分辨的刚度各向异性中。具体来说，本研究实现了从微米级（细胞）到毫米级（组织）的空间刚度各向异性。此外，光敏材料允许在细胞播种后的特定时间点引入刚度各向异性，便于研究它们对细胞和组织定向的时间影响。使用心脏成纤维细胞（cFBs）对这些系统进行了测试，众所周知，成纤维细胞对各向异性心脏组织的重塑至关重要。结果表明，2D刚度微图案可诱导 cFBs 各向异性对齐，与刺激时间无关，但取决于微图案间距。cFBs 对3D刚度大图案也表现出有组织的对齐，取决于刺激时间，并且在时间上紧随（较慢的）ECM 共同对齐之后。总之，所开发的模型系统有助于从根本上了解引导细胞和 ECM 定向的基本机械生物学因素，如硬度引导和边界约束。相关工作以题为“Steering cell orienTAtion through light-based spatiotemporal modulation of the mechanical environment”的文章发表在2024年04月16日的国际顶级期刊《Biofabrication》。
1. 创新型研究内容
本研究克服了上述用于研究细胞-ECM 各向异性的局限性，创建了可对组织硬度各向异性进行时空控制的2D和3D体外系统。为此，使用了一种市售的光敏水凝胶--甲基丙烯酰明胶（GelMA），这种水凝胶在紫外线照射下会发生交联，从而增加其硬度。通过这种方法可以创建具有微米分辨率的空间硬度图案（微图案）。在2D系统中，GelMA 通过由紫外线激光器通过数字微镜装置（DMD）过滤组成的照明装置，照射到微米分辨率的紫外线图案上。研究表明，线性线索（如蛋白质图案）可引导细胞在2D系统中的定向，受此启发，本研究设计了具有类似微米尺寸的线性硬度图案。通过紫外线介导的 GelMA 交联，可以在细胞播种后的某个时间点（6 小时）在 cFB 上施加硬度图案。在这一系统中，cFB 沿刚度图案的方向排列，这取决于图案的宽度，但与创建刚度图案的时间点无关。3D系统由含有 cFB 的胶原蛋白水凝胶组成，该水凝胶通过浇注 GelMA 水凝胶进行约束，以生成毫米尺度的刚度各向异性（宏观图案）。cFB 和 ECM 沿着刚度约束的方向定向，其定向受细胞密度和应用刚度刺激的时间的影响。因此，本研究开发了2D和3D体外系统来研究刚度各向异性如何影响细胞定向。光敏水凝胶的使用使我们能够随着时间的推移引入各向异性，为研究如何利用硬度线索引导细胞和 ECM 的定向提供了新方法，并可直接应用于组织工程和再生。
【创建具有细胞尺寸分辨率的2D线性刚度微图案】
本研究的目标是利用投影介导的交联 GelMA 10% 所表现出的硬度多变性，使细胞暴露在高空间分辨率的硬度模式下，从而控制细胞定向。之前的研究表明，细胞会根据地形或配体线性微图案定向。受这些研究的启发，本研究制作了硬度交替的线性微图案。特别是，使用投影照明（20 μm、50 μm 和 200 μm）将水凝胶暴露在紫外线图案下，并用 50 μm 的非照明区域隔开（图 1(A) 和 (B)）。为验证该技术是否能成功诱导出交联 GelMA 的图案，将这些水凝胶与 RhoMA 混合（图 1(C)）。由于 RhoMA 会在光引发剂和紫外线的作用下与 GelMA 发生交联，因此观察到的 RhoMA 强度较高的线性图案证实在紫外线处理下形成了交联图案，图案的大小与照射区域的宽度完全一致（图 1(C) 和 (D)）。
图1 在2D体外系统中生成细胞大小分辨率的硬度微图案
【2D刚度微图案引导 cFBs 方向】
鉴于之前已证实地形和配体线性模式对细胞定向的影响，本研究假设线性硬度模式可以引起类似的定向反应。本研究用 cFBs 来验证该假设，cFBs 是塑造结构和支撑心肌组织的最重要细胞类型。培养 24 小时后（TA = 24 小时），当线宽为 20 和 50 μm 时，cFB 细胞骨架显示出沿着僵硬图案方向的优先方向性（90°，图 2（A）和（B））。根据肌动蛋白细胞纤维的角度方向对有序参数（S）进行的量化证实，这种反应取决于线条的宽度（图 2(C)）。特别是，20 微米图案尺寸的 S 值最接近-1，表明对图案方向（90°）有强烈的偏好方向性。与无图案对照组和均匀光照的样品类似，播种在 200 μm 样品上的 cFB 没有表现出优先方向性，而 50 μm 样品则表现出介于两者之间的反应（图 2(C)）。为进一步测试2D系统的潜力，同时证实 cFB 定向来自机械传感的假设，量化了无图案基底上的 YAP 细胞核与细胞质比率，并将其与 20 μm 图案样本上的数值进行比较，因为 cFB 在此条件下显示出最强的排列。在有图案的水凝胶上培养的细胞的这一比率明显更高（图 2(D)），这支持了本研究的结论，即 cFB 对线性硬度图案具有机械敏感性，并以线宽依赖的方式定向。
图2 cFB 沿2D刚度微图案的方向定向
【2D刚度微图案和 cFB 方向的时间控制】
心肌梗死的主要后果之一是心脏组织各向异性特征的逐渐丧失。刺激细胞从各向同性组织转回各向异性组织的信号仍有待进一步研究。因此，通过对初始各向同性的细胞培养施加硬度线索，测试本研究的系统是否可用于这种情况。在稳定交联后，直接将 cFBs 接种到均匀的 GelMA 水凝胶上，并让其附着 T0 = 6 小时，以获得初始各向同性的细胞组织（图 3(A)）。之后，用投影系统照射这些系统，以获得 20 × 50 μm 的硬度图案。在分析之前，让 cFB 再适应硬度环境的变化达 TA = 24 小时（总培养时间为 30 小时）。6 小时后微图案水凝胶的刚度曲线（图 3(B)）与 0 小时的刚度曲线（图 1(E)）相似，刚度范围从 1.5 到 4 kPa（图 3(B)）。与此相一致的是，在暴露于硬度图案 24 小时后，cFB 显示出明显的朝向硬度微图案方向的取向（图 3(C) 和 (D)），这与在预图案水凝胶上播种的 cFB 类似（图 2）。此外，细胞存活率测定证实，细胞在光照后仍能保持存活率（图 S6）。因此，我们的系统不仅能以空间分辨率，还能以时间分辨率研究细胞（再）定向对2D线性硬度线索的响应。
图3 2D刚度微图案的时间控制
【在3D细胞培养物中生成硬度大图案】
由于体内细胞被3D ECM 包围，而 ECM 的结构受细胞影响并以相互依赖的方式发生动态变化，因此接下来的目标是开发一种类似的系统，对细胞和 ECM 的3D定向进行类似的时空控制。特别是，本研究发现单轴约束静态组织可提供使细胞和 ECM 对齐的硬度线索，因此本研究利用 GelMA 的交联特性开发了单轴约束和时间动态3D组织。获得的3D体外系统基于嵌入胶原 I 凝胶中的 cFB，这些 cFB 受 GelMA-胶原光敏水凝胶的单轴约束（图 4（A）和（B））。生物制造策略概述如下：(i) 将胶原 I 水凝胶与 cFB 混合并浇铸在 3D 打印模具中（图 4(A) 和 (B)，第一列）；(ii) cFB 在胶原凝胶中扩散和生长一段时间（T0）；(iii) 最后在含有 cFBs 的胶原水凝胶两侧加入 GelMA-ColI 水凝胶，并用紫外线照射使 GelMA 交联（图 4（A）和（B），第二列），从而增加其刚度并为相邻的胶原水凝胶提供单轴刚度约束（图 4（A）和（B），第三列）。值得注意的是，这种生物制造策略提供了对时间 T0 的控制，而时间 T0 是由 GelMA 的僵化所提供的刚度线索的启动时间。
图4 利用刚度各向异性研究细胞和 ECM 定向的3D体外系统
为验证本研究的假设，测量了 2 毫米和 5 毫米3D系统中经紫外线处理的 cFBs 在 T0 = 1 小时后的取向（图 5(A)）。不出所料，TA = 24 小时后，位于 2 毫米构建体中心的3D cFB 在受限方向上呈现对齐（图 5）。5 毫米构建体中的细胞也表现出类似的排列方向，但排列程度明显较低（图 5），从而证实了构建体的大小会影响细胞的反应。受约束距离对细胞行为影响的启发，本研究表征了界面区域的细胞定向（图 5（B）和（C））。令人惊讶的是，虽然填充在 2 毫米构建体中的 cFBs 仍显示出在约束方向上的排列，但 5 毫米构建体中的 cFBs 则更多地随机排列，表现出之前在其他研究中也观察到的排列异质性。有趣的是，cFB 的排列主要局限于 XY 平面（刚度各向异性平面）。总之，本研究的3D系统可以让细胞暴露在整个胶原凝胶中不同的硬度曲线下，从而诱导出依赖于曲线和空间异质性的 cFBs 排列。尺寸上的多样性也为将来研究细胞感知单轴约束提供的硬度线索的长度极限提供了更多可能。
图5 cFB 在施加刚度模式 24 小时后沿刚度各向异性方向进行3D定向
【cFB 对3D硬度宏图案的取向取决于细胞密度和 T0】
在证实了本研究的系统具有校正 cFB 的潜力之后，本研究验证该系统在修改与细胞（再）定向相关的其他参数方面的多功能性。研究表明，3D胶原构造中细胞的反应取决于机械刺激的时间和细胞的密度。不同的反应似乎源于不同的细胞-细胞和细胞-ECM 相互作用。以前的研究侧重于改变循环应变启动的时间，而本研究的系统则可用于改变硬度各向异性刺激的启动时间（T0= 1 h、3 h、ON/6 h）。T0 可调性允许细胞在施加刚度刺激前初步适应和重塑周围环境。为进一步研究硬度大模式在3D中指导 cFB 组织的能力，本研究探究了两个基本参数：细胞密度和硬度提示启动时间T0。通过分析紫外线照射后的不同时间点（TA = 0 h、24 h、72 h），本研究获得了 cFBs 定向响应的时间动态信息（图 6(A)）。细胞的取向通过阶次参数 S 进行量化，阶次参数 S 来自角度分布直方图 h(θ)。此外，还评估了紫外线照射后 cFB 的存活率。
图6 3D体外系统刚度模式的时间控制
【3D体外系统的刚度大小和药理操作】
与之前的大多数3D系统相比，本研究的策略还能相对容易地改变机械约束的影响。体外系统还可用于使细胞接受药理学治疗。为了解这些修改对细胞排列可能产生的影响，对表现出最大排列（1 M 细胞 ml-1，T0 = 3 h，TA = 24 h）和最小排列（100 k 细胞 ml-1，T0 = 3 h，TA = 24 h）的条件进行了扰动（图 5）。将 GelMA 的硬度降低 75%（相当于将硬度降至 5-7 kPa）会导致高细胞密度样品的细胞排列失调。这证实了在本研究的系统中，硬度线索对细胞排列的重要性。尽管如此，将低细胞密度样本的硬度提高到 40 kPa并没有对细胞产生重大影响，细胞仍然表现出随机取向。这表明细胞与细胞之间的距离可能在细胞（再）组织过程中发挥作用，可能是由细胞收缩性介导的。因此，为评估药理处理对该系统的影响，本研究探索了 ROCK 抑制剂的使用（在 T0 = 3 h 时创建约束时添加），它与细胞收缩力、肌动蛋白动力学和细胞（再）定向直接相关。与之前的研究一致，ROCK 处理导致机械响应性细胞排列明显减少（图 7(D)）。总之，这些扰动展示了所设计的3D系统的多功能性，可用于探索影响细胞对硬度线索的（再）定向响应的不同机制。
图7 3D体外系统可用于研究硬度大小和药理治疗
【3D体外系统可用于研究 ECM 重塑】
细胞定向对 T0 的依赖性（图 6）表明，细胞-ECM 相互作用可能会干扰细胞对硬度的（再）定向响应。为验证这种相互作用并进一步测试3D系统的多功能性，本研究对显示出一致配向反应的组织中的胶原蛋白 I 进行了成像（1 M 细胞 ml-1，2 mm 间距，图 6(D)）。总体而言，胶原基质表现出与 cFBs 相似的定向趋势，但程度要低得多。在 TA = 0 h 时，ECM 显示出与 T0无关的组织，其方向略微垂直于约束方向（图 8（A）和（B））。随着时间的推移，与 cFB 的情况类似，刚度约束的启动促使 ECM 平行于约束方向排列（图 8(A)、(B)）。然而，与 cFBs 相比，这种反应要低得多，也慢得多，在TA= 24 h 时，T0 = 1 h 和 3 h 时观察到各向同性组织。ECM 的这种延迟反应表明，cFBs 不是受 ECM 的定向引导，而是首先对僵硬模式做出反应，随后排列和重塑周围的 ECM。纵向 qPCR 分析（图 8(C)）显示：cFBs 的 ECM 蛋白（胶原 I 和纤连蛋白）基因表达随着培养时间的延长而减少，而 ECM 降解相关基因（MMP9、TIMP1）的表达随着时间的延长而增加。因此，cFB 最有可能通过降解介导的机制重塑基质。此外，本研究的3D系统还可以对 ECM 网络组织进行成像和量化，从而从根本上了解刚性引导组织对 ECM 重塑的作用机制和原因。
图8 3D系统中的 ECM 重塑
2. 总结与展望
总之，本研究开发了体外模型系统，用于在不同尺寸、长度尺度和时间范围内操纵和研究异质刚度各向异性的影响。这些系统可以测试药理处理的效果，然后进行标准的细胞和 ECM 分析，包括（实时）显微镜、免疫染色和 qPCR。总之，本研究中开发的2D和3D系统具有巨大的潜力，可用于了解细胞排列的机械基础，并有助于设计恢复细胞和 ECM 排列的机械疗法，从而改善组织功能。
了解更多
关注“EngineeringForLife”，了解更多前沿科研资讯
