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系统代谢工程改造谷氨酸棒杆菌高产L-丙氨酸
作者：
吴晨1，王泽婷1，赵桂红1，吕庚承1，王非傲1，刘月香1，陈宁1,2,3，李燕军1,2,3*
单位：
1．天津科技大学 生物工程学院
2．天津科技大学 工业发酵微生物教育部重点实验室
3．天津科技大学 代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室
基金项目：
国家重点研发计划“绿色生物制造”专项（2021YFC2100900）
摘要&关键词
摘要：L-丙氨酸是一种重要的天然氨基酸，广泛应用于医药、食品、饲料等领域。目前L-丙氨酸主要通过大肠杆菌来生产，开发安全、工业稳定的谷氨酸棒杆菌生产菌株具有重要的意义。该研究筛选了外源丙氨酸脱氢酶，在不以其他氨基酸为氨基供体的条件下高效率合成L-丙氨酸。强化非PTS葡萄糖摄取途径，极大地促进了细胞的生长和L-丙氨酸的合成。引入异源ED途径，通过4步反应即可实现EMP途径10步反应供应前体物丙酮酸，进一步提高了L-丙氨酸的产量。此外，为了避免抗生素的使用和保证菌株的遗传稳定性，将关键基因整合到基因组上。最终工程菌株在5 L发酵罐发酵48 h产生104 g/LL-丙氨酸。该研究为利用谷氨酸棒杆菌工业化生产L-丙氨酸奠定了基础，同时为其他丙酮酸族产品的代谢工程研究提供了参考。
关键词：谷氨酸棒杆菌；L-丙氨酸；丙氨酸脱氢酶；非PTS系统；EMP途径；ED途径
主要结论
本研究以谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032 strpR为出发菌株，首先筛选了不同来源的丙氨酸脱氢酶并多拷贝整合到基因组中来促进L-丙氨酸的合成；然后在敲除ldhA的同时整合大肠杆菌来源的丙氨酸输出蛋白基因alaE，引入非磷酸转移酶系统（phosphotransferase system, PTS）来促进葡萄糖的吸收和细胞的生长；进一步地，通过对比研究强化糖酵解关键基因和引入Entner–Doudoroff（ED）途径来促进前体物丙酮酸的供应。最终，获得了一株高产L-丙氨酸的工程菌株。
图1 谷氨酸棒杆菌中L-丙氨酸合成途径及代谢工程改造策略
Fig.1 L-alanine biosynthetic pathway in Corynebacterium glutamicum and metabolic engineering strategies
注：蓝色代表基因过表达；红色代表敲除；绿色代表引入外源基因
a-过表达不同来源丙氨酸脱氢酶基因菌株的L-丙氨酸产量; b-基因组整合不同拷贝数枯草芽胞杆菌丙氨酸脱氢酶基因菌株的L-丙氨酸产量
图2 质粒过表达不同来源丙氨酸脱氢酶基因和基因组整合不同拷贝数枯草芽胞杆菌丙氨酸脱氢酶基因
菌株的L-丙氨酸产量
Fig.2 L-alanine production by strains with plasmid-borne expressing of different alanine dehydrogenase (alaD) genes and those with genomic integration ofalaD with different copies
a-生长曲线; b-L-丙氨酸产量
图3 不同菌株摇瓶发酵的生长曲线和L-丙氨酸产量
Fig.3 Cell growth andL-alanine production by different engineered strains
a-基因组整合EMP和ED途径关键基因; b-质粒过表达不同来源ED途径基因
图4 增强丙酮酸供应对L-丙氨酸产量的影响
Fig.4 Effects of enhancing pyruvate supply by overexpressing key genes in EMP and ED pathwayson the production ofL-alanine
团队介绍
天津科技大学代谢工程研究室（陈宁教授团队）主要致力于氨基酸、核苷及其衍生产品的高端绿色制造技术开发，形成了代谢工程育种和代谢控制发酵2个特色研究方向。在工业微生物的系统生物学分析及定向选育、发酵过程控制及产业化放大、发酵产品的分离技术开发等方面开展了开拓性的研究工作，多项研究成果在发酵行业中推广应用。近年来，承担国家“863”项目、国家重点研发计划项目、国家自然科学基金项目、天津市科技支撑计划项目等国家与省部级科研项目40余项，获得科技奖励12项，发表科研论文100余篇，出版著作10部，授权国家发明专利30余项，参与制定标准20余项。
通信作者
通信作者李燕军，天津科技大学生物工程学院副教授，博士生导师。天津市“131”人才计划第三层次人选，中国微生物学会会员。科研领域主要为氨基酸、核苷及衍生产品工程菌株的构建和代谢控制发酵。近年来，在Metabolic Engineering，Bioresource Technology，Microbial Cell Factories等期刊发表论文10余篇，授权国家发明专利3项。主持国家重点研发计划子课题、国家自然科学基金、国家博士后科学基金等多项国家级课题。主持完成多项企业横向项目。
本文图片来源于文章原文及作者团队。
