封面文章

磁性聚合物微球固定化发酵液中脂肪酶的研究

作者：

郭俊宏1，王添誉1，孙西同2，李佥1*，陈晓艺1，李苗1，曾祥冰1，黄帆1，李宪臻1*

单位：

1．大连工业大学 生物工程学院

2．大连工业大学 轻工与化学工程学院

基金项目：

国家自然科学基金青年基金项目(31601411, 21804129, 22108024)；辽宁省教育厅科学研究项目(JYTMS20230423)

摘要&关键词

摘要：脂肪酶是一类功能多样且应用广泛的酶，但是由于游离酶酶活易损失且难以分离回收，通常不适合实际应用。为了解决实际应用中游离脂肪酶的稳定性和重复使用性较差的问题，该研究首先使用近平滑假丝酵母发酵生产脂肪酶，然后合成了聚酰胺-胺树枝状大分子接枝的聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球（Fe3O4@PMMA/PAMAM），并用多种方法对其进行表征。进一步将Fe3O4@PMMA/PAMAM作为载体用于固定化脂肪酶，最优固定化条件为戊二醛用量0.6 mL、固定化时间5 h、固定化pH 8.0、固定化温度35 ℃，所得的固定化脂肪酶活力为864 U/g，酶活力回收率为74.29%。与发酵液中的游离脂肪酶相比，固定化脂肪酶的热稳定性和pH稳定性均明显增强。在连续循环使用10次后，固定化脂肪酶仍能维持72.23%的酶活力。在4 ℃下储存30 d后，固定化脂肪酶仍能保留71.44%的酶活力。

关键词：磁性材料；树枝状接枝；固定化脂肪酶；酶学性质；近平滑假丝酵母

主要结论

为了解决实际应用中游离脂肪酶的稳定性和重复使用性较差的问题，本研究首先使用近平滑假丝酵母发酵生产脂肪酶，在采用共沉淀法制备油酸修饰的Fe3O4基础上，使用悬浮聚合法合成了聚甲基丙烯酸甲酯磁性微球[Fe3O4@Poly(methyl methacrylate)，Fe3O4@PMMA]。进而通过发散合成法合成了树枝状大分子接枝的磁性聚合物微球(Fe3O4@PMMA/PAMAM)，并通过SEM、DLS、EDS、EA、FT-IR、VSM、XRD、TGA等多种方法进行表征，证明了Fe3O4@PMMA/PAMAM及固定化脂肪酶均被成功合成，Fe3O4@PMMA/PAMAM为微米级微球且具备超顺磁性和良好的磁响应性，其晶体结构在修饰过程中没有发生明显变化。然后将Fe3O4@PMMA/PAMAM用于固定化假丝酵母发酵生产的脂肪酶，确定了最佳固定化工艺条件，即戊二醛用量为0.6 mL、固定化时间为5 h、固定化pH值为8.0、固定化温度为35 ℃，固定化脂肪酶酶活为864 U/g。发酵液中的脂肪酶和固定化脂肪酶的最适反应温度均为50 ℃，最适反应pH值则分别为8.0和9.0，Fe3O4@PMMA/PAMAM固定化脂肪酶能在更宽的反应温度和反应pH值范围内保持较高的酶活。在50 ℃下热处理5 h后，发酵液中的脂肪酶的剩余酶活仅为15.48%，而固定化脂肪酶则保持了50.97%的酶活。在pH为9.0的PBS缓冲液中处理5 h后，发酵液中的脂肪酶的剩余酶活仅为34.25%，而固定化脂肪酶则保持了81.74%的酶活。脂肪酶固定化到Fe3O4@PMMA/PAMAM上后，热稳定性和pH稳定性均显著提高。重复使用10次后，固定化脂肪酶仍能维持72.23%的酶活。在4 ℃下储存30 d后，固定化脂肪酶仍能保留71.44%的酶活。实验结果表明，Fe3O4@PMMA/PAMAM固定化脂肪酶有着较高的酶活、良好的稳定性和重复使用性。

因此，Fe3O4@PMMA/PAMAM固定化脂肪酶的这些优点对于脂肪酶的广泛实际应用具有非常重要的意义，同时，Fe3O4@PMMA/PAMAM将在未来生物催化领域有着广阔的应用前景和巨大的发展潜力。

a-扫描电镜图；b-粒径分布

图1 Fe3O4@PMMA/PAMAM的扫描电镜图像和粒径分布

图2 Fe3O4@PMMA/PAMAM的N元素能谱结果

图3 Fe3O4@PMMA/PAMAM的磁滞回线

a-重复使用性；b-储存稳定性

图4 固定化脂肪酶的重复使用性和储存稳定性

团队介绍

大连工业大学微生物资源与生物催化团队，在团队负责人李宪臻教授带领下，依托生物催化技术国家与地方联合工程实验室、辽宁省发酵工程重点实验室、辽宁省海洋生物催化重点实验室、辽宁省发酵工业产品工程技术研发中心等科研平台，具有主持国家、省市级重点科研项目的经历，在微生物资源、生物催化与生物转化领域具有明显优势和特色，在国内外具有重要影响力。李佥副教授负责的科研小组围绕新型生物材料、酶固定化和生物催化技术相关领域，开展了较为深入的研究，近五年发表高水平文章20余篇。

第一作者

郭俊宏，硕士研究生，主要从事新型生物材料设计及酶固定化方面的研究。

通信作者

李佥，副教授，硕士生导师，主要从事微生物发酵过程调控、新型生物材料研发及酶固定化技术研究，获批国家自然科学基金项目1项，省级科研项目3项，发表中英文科研论文30余篇，主持省级一流课程1项，省级教改项目2项，获得省级教学竞赛二等奖1项、三等奖2项，培养研究生近30名。

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