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控制和局部递送治疗药剂对于增强药物效果同时最小化全身性副作用的发生具有很重要的意义。控释可以通过各种递送系统实现，包括水凝胶。它们的半固体三维网络通常由亲水性聚合物和高水分含量（通常> 90% w/w）组成，并且具有良好的组织相容性。此外，它们可调的机械强度使它们非常适合各种组织的机械要求。然而，尽管水凝胶作为大分子如蛋白质的有效递送系统，它们的多孔结构允许亲水小分子容易地扩散出来，通常导致大量的初始突释和较短的释放持续时间。特别是在物理交联的水凝胶中（即通过静电、氢键或疏水键交联），由于它们的基质可以迅速膨胀和消散，释放尤其迅速，但即使在水凝胶中的聚合物是共价交联的情况下，小分子也可以通过其多孔网格快速释放。解决这一挑战可能有益于递送小亲水药物用于各种病理，如疼痛管理、抗菌治疗和癌症。虽然局部施用低分子量亲水性药物的控释可以在目标部位维持高浓度，减少全身性副作用，并提高患者的依从性。然而，实现低分子量亲水性药物的缓慢释放非常困难，主要因为药物会迅速从药物递送系统中扩散出来。

来自美国哈佛大学医学院的Daniel S. Kohane团队开发了一种完全基于脂质体自组装的可注射且自愈合的水凝胶。通过修改胆固醇含量和表面电荷来诱导脂质体的胶凝，而不损害其结构完整性。小亲水分子荧光素钠，要么装载在脂质体外的间隙中，要么包裹在脂质体的水核内。这种包裹策略使得可以根据凝胶的机械强度实现可控和可调的释放曲线。该水凝胶具有较高的机械强度、最小的膨胀和缓慢的降解。基于脂质体的水凝胶在体内具有延长的机械稳定性，并且没有局部不良反应。这项工作展示了一类新型的可注射水凝胶，有希望成为多功能的药物递送系统。相关工作以题为“Injectable Hydrogel Based on Liposome Self-Assembly for Controlled Release of Small Hydrophilic Molecules”的文章发表在2024年06月02日的期刊《Acta Biomaterialia》。

1.创新型研究内容

本文假设：通过减少静电排斥和增加膜的灵活性，脂质体可以凝胶化。由此，本文设计了一个带负电的脂质体制剂，它可以自组装成一个可注射的水凝胶（GelLip），同时保留脂质体的结构完整性，而不需要额外的凝胶剂。只有在表面电荷被屏蔽时，即简单地通过增加悬浮液的离子强度（例如，添加等渗氯化钠），凝胶化过程才会开始，而在低离子条件下则阻止凝胶化。小亲水药物可以被包裹在脂质体的水核中和/或脂质体外的间隙中，允许实现各种释放曲线。脂质体的胆固醇含量和表面电荷是凝胶形成的主要驱动力。由于阳离子脂质体被认为比阴离子脂质体更具毒性，因此未对阳离子脂质体进行探索。水凝胶展现出高且可调的机械强度，通过针头挤压后迅速愈合，低膨胀，缓慢降解，体内注射后的机械稳定性和高生物相容性，所有这些对于生物医学应用来说都是重要的特性。

【影响GelLip形成的物理化学参数】

基于脂质体凝胶化原理，本文通过减少脂质体的表面电荷（即低静电排斥）和增加它们的膜灵活性，用改良的薄脂膜水合法制备了由1,2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DSPC）组成的低表面电荷且不含胆固醇的脂质体。为评估胆固醇的影响，制备了含有胆固醇的带负电脂质体（Chol+ Lip），其摩尔比为3:1:2（分别为DSPC：DSPG：胆固醇），其物理化学性质与不含胆固醇的脂质体（Chol− Lip）相似。将Chol+ Lip（图1b）和Chol− Lip（图1c）暴露于通过添加NaCl而增加离子强度的介质中，直至最终浓度为9% w/v。Chol+ Lip没有形成水凝胶，但Chol− Lip在NaCl浓度超过0.45% w/v时凝胶化，对应的zeta电位为-34 ± 1 mV或更低（绝对值）。Chol+ Lip和Chol− Lip的zeta电位（绝对值）随着离子强度的增加而相似地降低，证明了胆固醇对凝胶化的抑制作用。水凝胶的储能模量（G'）（在0.9% NaCl中）随着胆固醇浓度的增加而降低，当胆固醇浓度超过0.8 mg/mL时，凝胶化被完全抑制（图1d）。在0.9% NaCl存在下，随着磷脂浓度从6.4增加到51.4 mg/mL，凝胶的G'从0.02 ± 0.01 kPa增加到16.3 ± 1.0 kPa（图1e）。在磷脂浓度≤ 3.2 mg/mL时，Chol− Lip不会形成凝胶（G' = 0）。基于这些结果，凝胶化被定义为材料不流动的状态（磷脂浓度> 12.8 mg/mL），对应于G'值> 0.34 ± 0.03 kPa。

图1 影响GelLip形成的物理化学参数

【GelLip 的形态】

透射电子显微镜（TEM）结果显示：水中的脂质体（凝胶化前；图2a）显示出平均大小为156 ± 20 nm的球形脂质体，与动态光散射（DLS）测量得到的尺寸相似。由于水凝胶的高粘度，制备用于TEM成像的水凝胶可能很困难，因此在将GelLip样品沉积在Cu网格上之前，先用纯水稀释并用200 µL通道移液器在25℃下机械破碎。破碎的凝胶由紧密堆积的脂质体组成，其平均尺寸与凝胶化前测量的相比没有显著变化（126 ± 34 nm；p > 0.05；图2b）。相邻脂质体界面的高倍放大显示了两个分离的脂质双层（图2c）。采用了改良的冷冻场发射扫描电镜（cryo-FF-SEM）方法来评估GelLip在其完整状态（无机械破坏）下的结构。GelLip由紧密堆积的微米级簇组成，形成了一个超分子凝胶网络（图2d）。其中，簇表面上的∼30 nm球形结构推测是在样品制备过程中水分升华时形成的NaCl盐晶体。

图2 Chol-Lip 和 GelLip 的形态

【GelLip 的机械性能】

本文通过振荡剪切流变学评估了不同磷脂浓度下GelLip的机械性能。GelLip在1-10%的应变范围内表现出断裂，这与磷脂浓度无关。对于所有测试的GelLip类型，在0.1%的应变下，G'在广泛的频率范围（1 - 200 rad/s）内高于G''，并且测量的G'与频率无关，证明了水凝胶具有良好的粘弹性特性。在加入NaCl后立即开始凝胶化，最终浓度为0.9%（t = 0时G' > G''），并在磷脂浓度为51.4、25.7和12.8 mg/mL时分别在大约50、75和150分钟达到平台期（图3a），表明凝胶化过程的完成。理想情况下，医用水凝胶的机械强度应在生物学相关温度范围内保持稳定。在25 – 40℃的温度测试显示，所有测试的磷脂浓度下的GelLip都有G' > G''（图3b），室温（25℃）下测量的G'减少了不到45%。磷脂浓度为12.8、25.7和51.4 mg/mL的GelLip在21天的时间范围内分别表现出低膨胀比为17.1%、36.3%和43.3%（图3c）。通过计算21天后剩余干磷脂的初始质量百分比来评估GelLip的体外降解（图3d）。降解随着磷脂浓度的增加而略微减少，但在所有情况下，> 84%的起始质量被保留。

图3 GelLip 的流变特性、膨胀和降解

本文通过振荡剪切流变学检查了不同磷脂浓度下GelLip的可注射性（图4a-4c）。在间歇施加的高应变（50%）和低应变（0.1%）条件下，GelLip在所有三个测试的磷脂浓度下都表现出剪切稀化行为（即，G'' > G'；液体行为），在高应变下允许流动，而在低应变下则表现出自愈行为（即，G' > G''），恢复到凝胶状的机械性能。因此，即使在G'超过16 kPa的51.4 mg/mL时，GelLip也可以通过23G针头轻松注射（图4d-f）。

图4 GelLip 的可注射性

【GelLip 中亲水分子的释放动力学】

本文通过在37℃下进行释放动力学研究评估了GelLip提供亲水性小分子控释的能力。选择NaFluo作为模型药物，因为它具有低分子量（376 Da）、高水溶性（500 mg/mL）、负电荷（最小化脂质体：染料静电相互作用），并且可以在非常低的浓度下被检测到。NaFluo通常用于模拟从不同的药物递送系统如水凝胶和脂质体中释放模型药物。NaFluo要么装载在脂质体外的空间（即，通过在凝胶化之前将预制的空脂质体与NaFluo溶液混合，50 µM），要么装载在脂质体的水性核心内（即，脂质体内空间；NaFluo浓度为49.7 ± 2.9 µM，包封效率为3.3 ± 0.2%）。与游离染料相比，将NaFluo封装在脂质体外减缓了染料的释放，并且这种减缓以磷脂浓度依赖的方式发生（例如，在24小时，与游离染料相比，来自磷脂浓度为12.8、25.7和51.4 mg/mL的GelLip的释放分别减慢了18%、34%和48%；p < 0.01；图5a）。为研究染料释放与GelLip机械强度之间的相关性，本文将24小时的累积释放量与从图1e获得的G'值进行了比较（图5b）。结果表明，在G'值高于0.3 kPa时已经可以获得减缓的释放。与在脂质体外封装的NaFluo相比，将NaFluo封装在脂质体的水性核心内进一步减缓了释放，在同一磷脂浓度下（例如，在48小时，释放分别减慢了55%和34%；51.4 mg/mL；p < 0.01；图5c）。

图5 GelLip的体外药物释放

【GelLip 的保留时间】

GelLip（磷脂浓度为51.4 mg/mL）的组织保留持续时间通过使用近红外染料Cy7标记的磷脂DSPE的前体脂质体进行了评估（通常用于评估体内生物分布）。将标记的GelLip注射到大鼠的坐骨神经中，并通过体内成像系统（IVIS）在预定的时间点监测荧光信号，随后使用Living Image软件进行图像分析（图6a和6b）。游离Cy7在注射后迅速减少荧光信号（1天后< 10%剩余），而GelLip的荧光信号则缓慢减少（7天后> 80%剩余）。为了确定GelLip在注射组织中的机械稳定性，在注射后的1、4和7天收获凝胶，然后测量水凝胶体积和G'（分别为图6c和图6d）。GelLip体积在7天内没有显著变化（图6c）。在注射后第7天观察到水凝胶的G'显著减少（从初始G'减少了89%）。然而，水凝胶在这7天的时间框架内保持了其粘弹性行为，并表现出相对较高的G'值，类似于磷脂浓度为25.7 mg/mL的GelLip的G'值（G' = 1233 Pa；图6d）。

图6 GelLip 在体内的保留时间和机械稳定性

【GelLip 的体内外生物相容性】

为评估组织反应，将GelLip以测试中最高的磷脂浓度（51.4 mg/mL）注射到大鼠大转子前内侧的肌肉周围结缔组织中。该位置通过骨骼标志容易识别（便于恢复），包括肌肉、结缔组织和血管。在注射后的第4天和第30天，将大鼠处死，并收获肌肉组织，通过苏木精-伊红染色进行组织学分析（图7a和7b）。在4天时对组织的显微镜检查显示，肌肉表面（即凝胶注射部位）出现穿透肌肉的淋巴组织细胞炎症。在注射后30天，仅存在轻微的残留炎症，并且在任何时间点都没有观察到肌毒性。

图7 GelLip 的体内生物相容性

2.总结与展望

本文开发了一类全新的水凝胶，其由自组装的脂质体组成且无需额外的凝胶剂，具有高且可调的机械强度、易于注射、快速自愈合、缓慢降解、在注射部位的延长滞留、体内高机械稳定性和良好的生物相容性，这些对于生物医学应用来说都是重要的特性。这种水凝胶可以实现小亲水分子的控制释放。通过改变脂质体的浓度以及将药物包裹在脂质体外的间隙和/或脂质体的水核内，可以修改释放曲线。

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