论文荐读

共识序列改造提高南极假丝酵母脂肪酶B的热稳定性

作者：

王亚婵1,2 李阳阳1,2 刘松1,2*

单位：

1. 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室(江南大学)

2. 江南大学 生物工程学院

基金项目：

国家重点研发计划项目(2021YFC2101400)

摘要&关键词

摘要：南极假丝酵母脂肪酶B(Candida antarctic lipase B，CALB)对水溶性和非水溶性底物均有良好的催化效率，广泛应用于各种工业领域，例如，生物柴油、对映体酮洛芬、甘油碳酸酯等的合成。为提高CALB热稳定性，将CALB与48条不同来源的脂肪酶序列进行比对获得共识序列，并初步确定了可显著提升CALB保守性的14个突变位点。随后，通过定点突变获得热稳定性显著提升的组合突变体G114A/A284N(CALBm)。结果显示，与CALB相比，CALBm在50 ℃下的半衰期提高了74.7%，达到14.5 min，但比酶活(16.1 U/mg)和kcat/Km[5 932.3 mmol/(L·min)]分别下降了36.3%和23%。分子动力学模拟表明，增加的疏水相互作用(G114 vs M83，G114 vs V84，G114 vs I121)和氢键(A284 vs G41，A284 vs A281)提升了CALBm蛋白分子的整体刚性和稳定性。分子对接分析显示，CALBm与底物分子之间作用力的减少可能是其活性降低的主要原因。研究结果将有助于提升CALB高温条件下的应用效果。

关键词：脂肪酶B；共识序列；热稳定性；酶学性质；分子动力学模拟；分子对接

主要结论

为满足工业生产的需要，提高CALB的热稳定性，本研究将南极假丝酵母来源的脂肪酶B（GenBank：Z30645.1）与48条不同来源的脂肪酶序列进行比对。选择对CALB热稳定性有潜在影响的14个点进行突变，并有序叠加，分析确定了热稳定性显著提升的组合突变体G114A/A284N（CALBm）。

a-CALB 及突变体纯化后的残余酶活和比酶活;b-组合突变体的残余酶活和比酶活

图1 残余酶活和比酶活变化

同时测定了CALB和CALBm的比酶活、kcat/Km及50℃下的半衰期（t1/2）。与CALB相比，CALBm 在50℃下的半衰期（t1/2）提高了74.7%，达到14.5 min，但比酶活（16.1 U/mg）和kcat/Km[5932.3 mmol/(L·min)]分别下降了36.3%和23%。最后，对突变前后氨基酸与周围氨基酸之间的相互作用进行分析。结果表明，新增加的疏水相互作用（G114 vs M83，G114 vs V84，G114 vs I121）和氢键（A284 vs G41，A284 vs A281）在一定程度上增加了CALB的刚性，促使热稳定性的提升。

表1 CALB和CALBm性质比较

图2 突变位点的相互作用力变化

本研究通过多序列比对，得到对CALB热稳定性有潜在影响的点进行突变，获得热稳定性提升的突变体CALBm，并对热稳定性提升的原因进行了分析。研究结果将有助于提升CALB高温条件下的应用效果。

团队介绍

通信作者

刘松，江南大学未来食品科学中心研究员，硕士生导师。从事工业酶分子改造和食品级微生物（链霉菌、曲霉等）表达系统的开发。近年来在Biotechnology Advances、ACS Synthetic Biology、Journal of Agricultural and Food Chemistry及Bioresource Technology等生物工程类SCI期刊上发表研究论文40余篇，出版英文专著1部（副主编）；授权发明专利40余项，其中国际专利4项；主持国家自然科学基金（面上项目2项、青年基金项目1项）、江苏省自然科学基金、国家重点研发计划子课题、863子课题等纵向科研项目及10余项横向课题；获得中国轻工业联合会科学技术进步奖一等奖（2018），中国商业联合会科学技术奖一等奖（2017）和特等奖（2022）。2022年8月，任中国食品科学技术学会酶制剂分会理事。

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