开学了！先来学习怎么样使用激光共聚焦吧！

一秒跳进大学生活 激光共聚焦显微镜 共聚焦显微镜 实验室日常 医学研究生日常 生物学研究生 线粒体 一篇文章就足够了，教你怎么样设置拍出完美共聚焦！无论是哪一家的共聚焦显微镜，说到底一张共聚焦图像的质量，主要是有这几个因素共同决定的:1、激光通道、 2、接收滤光片波段范围；3、激光强度；4、增益（Gain）；5、pinhole(针孔大小)；6、扫描的分辨率；7、其他设置（平均次数Averaging或驻留时间 Dwell time）。 怎么样去设置才能拍到一张图像不过曝，细节丰富，又没有噪声的共聚焦图像呢？ 第一步，根据我们的染料或荧光蛋白确定激光通道。例如GFP蛋白，使用488通道进行激发。 第二步，根据染料的激发与发射光谱。选择合适范围的滤光片波段，例如GPF蛋白，可选500-550范围。一般来说，滤光片比激发光波段高一段就行。 PS:前面两步比较简单，因为基本上大家的染料或者蛋白选定了，基本上就确定了。重点是接下来的3个参数，如何去选择！ 激光强度、增益、pinhole！ 简单地说，这三者越大，信号越强，但是各有利弊。 激光强度越大，信号越强，但是样本漂白更严重。 增益越大，信号越强，但是噪声噪点会很大！（这个值很关键，如果拍出来噪声很多，基本上就是这个值拉太大了）。 Pinhole越大，信号越强，但是理论上光学分辨率越差（准确的说应该是离焦层信号越多，也就是光学选层能力越差，所以pinhole越小，分辨率越高，但是同时信号会被遮挡的更多，图像越暗）。 我一般喜欢的调节思路是: 先把pinhole调到默认1个单位。然后把增益调到10%；激光强度调整到20%左右。点开live观察信号，如果此时信号很亮，则继续调小增益，调到5%，甚至0.5%或者0.2%。只要信号足够强，增益可以足够小，越小信噪比越好。 如果这时候信号依然很强，就可以调低激光强度和pinhole。 如果增益调到5%（这个值不一定就是5%，根据样本来）已经很弱，则尝试增大激光强度和pinhole，看能否把信号提亮。 确定好增益、激光强度、pinhole之后，在拍摄前，把分辨率调整到2048*2048、适当增加平均次数Averaging或驻留时间 Dwell time，比如增加到2或者4，可以再稍微让噪声更加干净一些，但是同时扫描速度会变慢。 对于共聚焦来说，图像质量很大程度上和成像速度是反比，想要一张图清晰，信噪比高，往往意味着扫描速度要慢。而增益调大会让图像充满噪声，所以我习惯调低这个值，适当增加激光强度和pinhole。