论文荐读

产甘油假丝酵母25S rRNA甲基转移酶BMT5对乙酸胁迫耐受的影响及应用

作者：

周柳1,2，陆信曜1,2 ，宗红1,2 ，诸葛斌1,2 *

单位：

1．江南大学 工业生物技术教育部重点实验室

2．江南大学 生物工程学院，工业微生物及多元醇研究设计中心

基金项目：

国家自然科学基金项目（22278187）

摘要&关键词

摘要：挖掘功能基因，提升菌株环境胁迫耐受性，对高效利用纤维素水解液产乙醇至关重要。产甘油假丝酵母（Candida glycerinogenes）是具有多重抗逆性的工业菌株，经基因组文库筛选，获得能够提高酵母乙酸耐受性的rRNA甲基转移酶基因CgBmt5。在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中表达CgBmt5提高了乙酸耐受性，重组菌在胁迫下乙醇产量60.5 g/L、提高17.7%。在C. glycerinogenes中过表达CgBmt5后，乙酸胁迫下乙醇产量提高17.6%，2种过表达的单位菌体产量、底物转化率、生产强度均有提高。进一步将C. glycerinogenes过表达菌应用于纤维素水解液发酵，乙醇产量提高71.7%，转化率提高65.0%，生产强度提高155.7%。乙酸胁迫下，过表达菌中脂质过氧化水平降低，且过氧化氢酶（catalase，CAT）和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性增加；转录分析发现，Pfk1和Arg3基因上调，Gpd1和Cox3下调，表明CgBmt5可能通过降低脂质过氧化水平、升高SOD和CAT活性及影响糖代谢和精氨酸合成促进菌株的乙酸耐受和胁迫下的发酵能力。该研究为酵母的胁迫耐受机制和纤维素乙醇技术发展提供了新的生物材料。

关键词：产甘油假丝酵母；基因筛选；环境胁迫；纤维素水解液；rRNA甲基转移酶

主要结论

1.CgBmt5对酿酒酵母乙酸耐受和发酵性能的影响

经基因组文库筛选、测序比对，获得促进菌株耐受乙酸的基因CgBmt5。与对照菌（S. cerevisiae/p414-kan）相比，重组菌S. cerevisiae/p414-kan-CgBmt5在85 mmol/L乙酸下生长更优（图1-a），滞后期缩短约12 h，乙醇产量60.5 g/L、提高17.7%；单位菌体乙醇产量12.9 g/L，提高27.7%；转化率41.6%，提高17.8%，生产强度提高17.6%，生物量无明显变化（图1-b）。上述结果表明，CgBmt5可以提高乙酸胁迫下酿酒酵母的生长及乙醇发酵性能。

a-85 mmol/L乙酸胁迫下点板结果；b-85 mmol/L乙酸胁迫下乙醇发酵性能

图1 CgBmt5对S. cerevisiae乙酸耐受及发酵性能的影响

Figure 1 Effects of CgBmt5 on acetic acid tolerance and fermentation performance of S. cerevisiae

2. 过表达CgBmt5对C. glycerinogenes胁迫耐受的影响

120 mmol/L乙酸胁迫下，在C. glycerinogenes中过表达CgBmt5，过表达菌株滞后期缩短24 h，乙醇产量62.7 g/L，提高17.6%，单位菌体乙醇产量12.3 g/L，提高17.1%；转化率46.1%，提高17.6%；生产强度提高47.7%，终生物量无明显差异(图2-a)。结果表明，在C. glycerinogenes中过表达CgBmt5可提高120 mmol/L乙酸胁迫下的乙醇发酵性能。

甘油是乙醇发酵的副产物，产量5.1 g/L，单位菌体甘油产量1.0 g/L，与对照无明显差异，生产强度提高了20.5%（图2-b）。结果表明，乙酸胁迫下，过表达CgBmt5不能提高菌株甘油积累量。

a- C. glycerinogenes乙醇发酵；b-乙醇发酵副产物甘油产量

图2 过表达CgBmt5对C. glycerinogenes乙醇发酵性能的影响

Fig.2 Effect of overexpression of CgBmt5 on the ethanol fermentation performance of C. glycerinogenes

为了探索过表达菌株的耐酸机制，进一步分析了过表达菌株的细胞膜脂质过氧化水平以及CAT和SOD的酶活性（图3）。在正常条件下，对照菌和过表达菌株的脂质过氧化水平相似。而在乙酸胁迫下，过表达菌株脂质过氧化水平降低18.1%（图3-a），表明CgBmt5可能通过降低过表达菌株的膜脂质过氧化水平从而调控细胞应对乙酸胁迫;过表达菌株CAT和SOD活性分别为9.2 U/mg蛋白、34.7 U/mg蛋白(图3-b)，增加73.6%和53.5%，表明过表达CgBmt5后菌株乙酸耐受性的变化与抗氧化酶活性增高有关。

a-C. glycerinogenes脂质过氧化水平；b-C. glycerinogenes过氧化物酶活性

图3 过表达CgBmt5对C. glycerinogenes脂质过氧化水平及过氧化物酶酶活的影响

Fig.3  Effect of overexpression of CgBmt5on lipid peroxidation level and peroxidase activity of C. glycerinogenes

注：图中胁迫条件均为120 mmol/L乙酸

为研究CgBmt5对菌株胞内代谢的调控机制，检测了乙酸耐受相关基因甘油-3-磷酸脱氢酶基因（Gpd1）、鸟氨酸氨基甲酰转移酶基因(Arg3)、质膜P2型H+-ATP酶基因（Pma1）、磷酸果糖激酶基因1（Pfk1）和细胞色素c氧化酶亚基Ⅲ基因（Cox3）的相关转录水平。乙酸胁迫下，这些基因部分上调（图4），其中Arg3的转录水平提高了4.8倍，糖酵解途径关键酶基因Pfk1上调1.5倍。以上结果表明，过表达CgBmt5能够影响上述酸胁迫响应基因的转录。

图4 乙酸耐受相关基因转录水平

Fig.4 Transcription levels of genes related to acetic acid tolerance

3. 过表达菌株利用纤维素水解液发酵乙醇

将CgBmt5过表达菌株C. glycerinogenesΔURA5/pURGAP-CgBmt5应用于纤维素水解液发酵乙醇，过表达菌株长势优于对照，生物量提高了67.6%；乙醇产量21.8 g/L，提高71.7%；单位菌体乙醇产量2.9 g/L，提高26.1%；转化率36.3%，提高65.0%，生产强度提高155.7%。综上所述，在C. glycerinogenes菌株中过表达CgBmt5可以显著提高菌株对多重胁迫、复杂环境的耐受性，从而提高纤维素水解液的乙醇发酵性能。

图5 CgBmt5过表达菌株利用纤维水解液发酵乙醇

Fig.5 CgBmt5 overexpressed strain ferments ethanol with fiber hydrolysateh

本研究证实CgBmt5通过影响过氧化物酶SOD和CAT的活性而缓解ROS对细胞造成的损伤以及影响C. glycerinogenesΔURA5酸胁迫响应基因Pfk1、Gpd1、Cox3、Arg3的转录，通过促进胞内精氨酸合成途径、上调磷酸果糖激酶Pfk1等方式提高菌株对乙酸的耐受性及乙酸胁迫下的乙醇发酵性能，增强纤维素水解液乙醇的单位菌体产量和底物转化率，为酵母胁迫耐受的研究和纤维素乙醇技术发展提供新的生物材料。

团队介绍

江南大学工业微生物研究室是由老一辈科研工作者建立和发展起来的我国最早开展工业微生物技术研究（1963年）的单位之一。主要研究方向为工业酵母Candida glycerinogenes的抗逆机制、底盘化改造及在高附加值化学品合成中的应用。课题组曾先后获得“国家发明二等奖”、“中国轻工业科学技术进步一等奖”、“中国粮油学会科学技术一等奖”和“中国商业联合会科技进步一等奖”等。

团队负责人

诸葛斌，江南大学生物工程学院教授，博士生导师，主要研究方向为工业酵母的抗逆机制及底盘化应用。江苏省“六大人才高峰”高层次人才，曾获得国家省部级科技进步一等奖3项、三等奖1项，市级1项，国内外学术期刊发表论文近200篇，主编、副主编或参编著作5部（国家“十一五”规划2部），发明专利21项。主持自然基金等国家项目6项、省部级3项、市级及企业多项。

引用格式

周柳,陆信曜,宗红等.产甘油假丝酵母25S rRNA甲基转移酶BMT5对乙酸胁迫耐受的影响及应用[J].食品与发酵工业,2024,50(01):1-6.图文供稿| 作 者