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基于代谢组学分析理性强化三羧酸循环提高L-丝氨酸产量

作者：

陈剑1,2 张晓梅1,2∗ 史劲松1,2 许正宏2,3

单位：

1．江南大学 生命科学与健康工程学院

2．宜兴市食品与生物技术研究院

3．江南大学 粮食发酵工艺与技术国家工程实验室

基金项目：

国家自然科学基金项目(32171470)

摘要&关键词

摘要：L-丝氨酸广泛应用于医药、食品和化妆品等领域,目前尚未实现微生物直接发酵糖质原料工业化生产L-丝氨酸。在前期研究中发现,谷氨酸棒杆菌A利用蔗糖和葡萄糖生产 L-丝氨酸产量存在差异。该文采用比较代谢组学的分析方法，研究谷氨酸棒杆菌A在不同碳源中的胞内代谢产物差异,揭示合成L-丝氨酸的关键代谢物，再考察外源添加主要关键代谢物对L-丝氨酸产量的影响。通过GC-MS及主成分分析和偏最小二乘判别分析，发现15种胞内代谢物可能与L-丝氨酸合成密切相关,其中三羧酸(tricarboxylic acid，TCA)循环中富马酸、琥珀酸、α-酮戊二酸、苹果酸及柠檬酸5种物质对L-丝氨酸合成影响较大;通过在培养基中分别添加这 5 种物质进行发酵，结果表明，富马酸对L-丝氨酸的产量影响最为显著，当添加 2 g/L 的富马酸时，L-丝氨酸的产量提高29. 8%。表明基于比较代谢组学分析理性优化培养基的方法可以提高L-丝氨酸的产量。

关键词：谷氨酸棒杆菌；L-丝氨酸；代谢组学；理性优化；微生物发酵

主要结论

本研究首先探究了一株产L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌A在以蔗糖和葡萄糖为唯一碳源下的发酵情况，发现谷氨酸棒杆菌A在蔗糖条件下发酵性能更为优异。

图 1 谷氨酸棒杆菌 A 利用蔗糖和葡萄糖发酵过程生长和残糖浓度曲线

Fig.1 Growth and sugar consumption ofC. glutamicumA on sucrose or glucose

表 1 菌株利用葡萄糖和蔗糖时胞外主要氨基酸积累情况

单位:g / L

Table 1 Extracellular accumulation of major amino acids in glucose and sucrose

本文接下来采用气相色谱-质谱（GC-MS）联用技术，利用比较代谢组学的方法分析谷氨酸棒杆菌A在葡萄糖和蔗糖为碳源时胞内代谢产物的差异；分析发现谷氨酸棒杆菌A在蔗糖培养条件下三羧酸循环及氨基酸代谢的整体水平高于葡萄糖，这种差异可能是菌株在蔗糖培养基中L-丝氨酸产量更高的原因。

a-GC-MS检测到的胞内代谢物分类; b-谷氨酸棒杆菌A 以蔗糖和葡萄糖为碳源时的热图

图 2 谷氨酸棒杆菌 A 在以蔗糖和葡萄糖为碳源时的代谢图谱

Fig. 2 Metabolic map of C. glutamicum A withsucrose and glucose as carbon sources

通过多元统计分析得知富马酸、琥珀酸、苹果酸、α-酮戊二酸对三羧酸循环代谢途径的影响较大。通过增加这些物质，可能会改善菌株的发酵性能。本文通过比较代谢组学分析对L-丝氨酸合成具有促进效应的关键代谢物，再通过提高关键代谢物的浓度进而使代谢途径向有利于产物生成的方向进行，在此基础上提出了蔗糖培养基的改进策略。结果表明，当外源添加2 g/L的富马酸时，L-丝氨酸产量提高了29.8%。表明基于比较代谢组学分析理性优化培养基的方法可以提高L-丝氨酸的产量。

1-葡萄糖; 2-6-磷酸葡萄糖; 3-3-磷酸甘油酸; 4-丙酮酸;5 6-磷酸果糖; 6-丙氨酸; 7-琥珀酸; 8-富马酸; 9- 柠檬酸; 10-苹果酸; 11-苯丙氨酸; 12-色氨酸; 13-脯氨酸; 14-甘氨酸; 15-蛋氨酸

图 3 胞内代谢物第一主成分 VIP 图

Fig. 3 Correlation size analysis of intracellular metabolites forL-serinesynthesis by PLS-DA

a-添加α-酮戊二酸; b-添加苹果酸; c-添加柠檬酸; d- 添加富马酸; e-添加琥珀酸

图 4 外源添加三羧酸循环关键代谢物对菌株发酵影响

Fig.4 Effect of exogenous addition of key metabolites of tricarboxylic acid cycle on fermentation of strain

团队介绍

江南大学系统发酵与制药工程研究室围绕重要微生物的系统代谢改造与优化、复杂微生物群落酿造机理的认识与功能调控开展研究，在氨基酸、维生素、甾体中间体等重要化学品的生物合成与绿色制造，功能糖、活性肽、药用真菌等营养健康产品的生物制造与功能产品开发，白酒、食醋、酱油或酱制品等酿造食品、新型调味品的产业技术升级等方面进行技术开发与应用推广，同时拓展生物饲料、生物农药等领域应用。研究室近年来主持承担国家重点研发计划、国家863项目、国家科技支撑、国家自然科学基金及部省级项目50余项，授权发明专利120余项，发表SCI论文200余篇，主编或参编国内外科技书籍6部，成果获国家及省部级科技奖励10余项。团队现有教授8人，副教授4人，高级实验师2人，博后2人，研究生100余人。

第一作者

陈剑，江南大学生命科学与健康工程学院2020级硕士研究生，生物与医药专业。研究方向：微生物发酵。

通信作者

张晓梅，江南大学生命科学与健康工程学院教授，工学博士。主要研究药用氨基酸菌种的代谢工程改造，着重开展发酵法生产L-丝氨酸的研发。主持国家自然科学基金面上项目、国家重点研发子课题和企业横向课题。“由糖质原料全发酵法生产L-丝氨酸的关键技术研究及产业应用”突破了L-丝氨酸生物合成途径改造的关键技术，获得了国际上最好的产酸水平。该成果获中国商业联合会科技进步一等奖，并在Trends Biotechnol, Appl Microbiol Biotechnol等期刊发表L-丝氨酸研究论文30余篇，授权中国发明专利10余项。

本文图片来源于文章原文及作者团队。