论文荐读

苯乳酸与DNA相互作用及其抑菌机制研究

作者：

贾以泽1,2，舒泉先3，丛瑞涛3，毛银1,2，周胜虎1,2*，邓禹1,2*

单位：

1．江南大学 粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心

2．江南大学 江苏省生物活性产品加工工程研究中心

3．山东渤海实业集团有限公司 山东省油脂油料精深加工技术重点实验室

基金项目：

国家重点研发计划项目（2022YFA0911800）；江苏省杰出青年基金项目（BK20220089）

摘要&关键词

摘要：苯乳酸作为新兴的绿色高效抑菌剂，是传统化学防腐剂的理想替代品，在食品发酵工业方面有着广泛的应用。该研究聚焦于苯乳酸与DNA的相互作用以及在苯乳酸胁迫下的关键基因表达变化。发现苯乳酸能够通过氢键作用与范德华力并以插嵌的方式与DNA相互结合。结合分子对接构建了苯乳酸-ctDNA结合模型，结果表明苯乳酸更倾向于插入DNA的CG碱基对之间。最后通过转录组测序分析了苯乳酸胁迫乳酸片球菌DY15后基因表达变化，发现差异基因富集于细胞壁成分与核酸合成修复方面，说明细胞壁与基因组DNA可能是苯乳酸的主要攻击靶点。乳酸菌酸胁迫应答机制的改变说明精氨酸代谢途径也可能是苯乳酸抑菌过程中的关键靶点，通过抑制基因表达从而降低细菌酸耐受性，进而抑制细菌生长。总而言之，该研究解析了苯乳酸的抑菌机制，为后续苯乳酸作为生物抑菌剂的应用提供了理论支撑。

关键词：苯乳酸；ctDNA；抑菌机制；光谱法；分子对接；转录组

主要结论

1.苯乳酸与DNA相互作用模式解析

DNA是苯乳酸起到抑菌效果的作用点之一，通过荧光猝灭实验，结合Stern-Volmer方程和Lineweaver-Burk对数方程分析了苯乳酸与DNA的相互作用。数据表明，猝灭常数Ksv随着温度的升高而降低，这表明猝灭不是由碰撞引起的，而是由络合物的形成引起的。猝灭速率常数Kq远大于2×1010L/（mol·s），表明苯乳酸-ctDNA的荧光猝灭机制是静态猝灭。此外，得到结合常数Ka值为8.57×104，而经典DNA嵌入剂溴化乙啶的结合常数Ka=1.4×106，证明苯乳酸结合能力低于溴化乙啶。最后，通过计算热力学参数得到结合过程中H和S均小于0，这说明苯乳酸与DNA的结合过程中既有氢键作用，也存在范德华力。

图1 ctDNA对苯乳酸荧光猝灭的Stern-Volmer拟合直线

Fig.1 Stern-Volmer plots for ctDNA quenching of PLA fluorescence

图2 ctDNA对苯乳酸荧光猝灭的Lineweaver-Burk拟合直线

Fig.2 Lineweaver-Burk plots for ctDNA quenching of PLA fluorescence

2. 苯乳酸与DNA结合方式研究

小分子与DNA的非共价结合方式主要有三种：静电结合、沟槽结合和插嵌结合。通过碘化钾猝灭实验和DNA熔点测定实验确定了苯乳酸是通过插嵌结合的方式插入了DNA内部的碱基对之间。进而通过了分子对接模拟了苯乳酸与DNA的相互作用，苯乳酸滑入碱基对CG之间，脂肪链部分的羟基和羧基作为氢键受体(供体)与碱基和脱氧核糖形成氢键，结合距离分别为2.2 Å, 2.0 Å, 1.7 Å，苯环部分通过堆积作用嵌入碱基对之间，与周围的碱基形成大量π-π作用。分子对接的结果与光谱结果相互印证，为苯乳酸与DNA之间的结合作用提供了进一步的证据，证明苯乳酸与DNA之间的结合是通过插嵌结合发生的。

图3 KI对苯乳酸的Stern-Volmer的拟合直线

Fig.3 Stern–Volmer plots of PLA by KI

图4 ctDNA的熔解曲线

Fig.4 Melting curve of ctDNA

图5 苯乳酸与DNA的分子对接模型

Fig.5 Molecular docking model of PLA with DNA

3. 转录组学分析苯乳酸与基因组DNA相互作用的影响

苯乳酸插入DNA中可能会影响细菌的正常转录，于是通过转录组测序分析了苯乳酸在与基因组DNA结合下对细菌转录的影响，解析细菌生长受到抑制的关键基因。发现苯乳酸主要影响细胞壁合成、核酸的复制与修复相关的基因转录，侧面证实了苯乳酸的攻击靶点是细胞壁和基因组的可能性。同时苯乳酸通过抑制精氨酸代谢途径的关键基因表达从而降低了细菌酸耐受性，进而通过生长环境的酸性来抑制细菌生长，与苯乳酸和有机酸的协同抑菌能够达到更好效果的结论相印证。

图6 差异表达基因的GO注释

Fig.6 GO analysis of differentially expressed genes

a –乳酸乳球菌DY15的耐酸应答机制，红色代表基因上调，蓝色代表基因下调，括号里为下调倍数; b –RT-qPCR测定受L-苯乳酸胁迫后精氨酸代谢途径中关键基因表达变化

图7 苯乳酸对乳酸片球菌耐酸应答机制的影响

Fig.7 Effect of PLA on acid tolerance response mechanism of Pediococcus acidilactici

团队介绍

江南大学绿色与合成生物制造研究室主要从事食品原料的合成生物学制造等方面的研究。在合成生物技术和微生物定向进化育种领域、酿酒酵母代谢工程、分子遗传学和细胞生物学等领域、生物基材料的合成及功能化应用领域、生物发酵饲料领域均有深入的研究。团队现有教授1名，副教授/研究员3名，实验师1名，共有硕士和博士研究生37人。研究成果发表在合成生物学和代谢工程权威杂志Chemical Engineering Journal、ACS Catalysis、Bioresource Technology和ACS Sustainable Chemistry & Engineering等。团队成员主持国家重点研发计划课题和子课题7项，国家自然科学基金面上和青年项目7项，省重点研发和省杰出青年基金等项目6项。

基于乳酸菌的相关研究建立了菌酶协同制备发酵饲料的关键技术，并与山东渤海实业有限公司、天邦食品股份有限公司和河南福源青阳生物科技有限公司、防城港澳加粮油工业有限公司和丰益（上海）生物技术研发中心有限公司等开展了技术研发和技术转让等合作，并建立了联合研究中心。并主持设计了防城港澳加粮油工业有限公司的年产10万吨发酵饲料添加剂生产车间已投入运营。

通信作者

邓禹，江南大学国家工程研究中心“绿色与合成生物制造研究室”负责人，教授，博导。毕业于美国弗吉尼业联邦大学化学与生命科学工程专业，工学博士。现为农业农村部神农青年英才、江苏特聘教授、江苏省杰出青年基金获得者、江苏省“双创团队”首席和江苏省双创人才。长期从事发酵工程，代谢工程，合成生物学，工业微生物等领域的研究。近年来在Nucleic Acids Research, ACS Catalysis, Chemical Engineering Journal等行业主流国际期刊发表SCI论文100余篇，申请发明专利70余项，其中授权36项；主持包括国家重点研发计划、国家自然基金等在内的国家及省部级科研项目10余项。

周胜虎，江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心，副研究员。毕业于江南大学发酵工程专业，工学博士。主要从事生物元器件的智能设计，微生物细胞工厂合成化学品和基于合成生物技术的农业污染物检测和降解等研究。获无锡市自然科学优秀学术论文奖和金龙鱼青年教师奖等。以第一/通讯作者(含共同)在生物技术杂志Nucleic Acids Research、ACS Catalysis和Metabolic Engineering等期刊发表SCI学术论文20余篇。作为第一发明人申请中国发明专利7项，授权中国发明专利2项。主持国家自然科学基金面上、青年项目、江苏省重点研发(现代农业)-重点项目和国家重点研发子课题等省部级及以上项目5项。

引用格式

贾以泽, 舒泉先, 丛瑞涛, 等. 苯乳酸与DNA相互作用及其抑菌机制研究[J]. 食品与发酵工业, 2024, 50(5): 67-75.