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分子改造羰基还原酶CpCR提高其催化合成2-苯乙醇能力

作者：

陈孟军1，2，吕育财1，2，龚大春1，2，郭金玲1，2*

单位：

1．三峡大学 生物与制药学院

2．湖北省生物酵素工程技术研究中心（三峡大学）

摘要&关键词

摘要：该研究对近平滑假丝酵母ATCC 7330羰基还原酶CpCR进行分子改造，以提高其催化合成2-苯乙醇的能力。通过易错PCR构建突变文库，利用2，4-二硝基苯肼高通量筛选阳性突变株，测序确定氨基酸突变位点。再通过蛋白质半理性设计进行虚拟饱和突变，采用定点突变技术进行构建和评价。筛选获得突变体T171F具有更强的催化能力和热稳定性。进一步考察了催化时间、温度、pH值和底物浓度对wtCpCR和T171F催化合成2-苯乙醇的影响。研究表明，酶最适催化合成2-苯乙醇的温度为30 ℃；T171F最适催化合成2-苯乙醇的pH为6.5；苯乙醛的质量浓度为1 000 mg/L时T171F产率可达91.24%，是wtCpCR的2.8倍。此外，突变体T171F相比wtCpCR催化时间由10 h降低到4 h，催化效率得到很大的提高。该研究为羰基还原酶催化合成2-苯乙醇提供科学基础，同时具有一定的应用价值。

关键词：羰基还原酶；易错PCR；2，4-二硝基苯肼；半理性设计；2-苯乙醇

主要结论

本文通过易错PCR技术构建羰基还原酶CpCR突变文库，利用2,4-二硝基苯肼（DNPH）能与醛或酮发生缩合反应，生成红色或黄色的二硝基苯腙沉淀，且所生成的硝基苯腙沉淀可被碱性溶液溶解而生成红棕色的溶液这一高灵敏度特征反应对易错PCR突变库进行96深孔板（2.2 mL）高通量筛选。

图1  DNPH法筛选流程

Fig. 1  Screening process for DNPH method

利用半理性设计进行虚拟饱和突变，羰基还原酶CpCR（PDB号：4OAQ）与PAAH分子对接如图2所示，酶与底物结合口袋及辅酶结合部位的氨基酸残基位点对酶的活力与具有重大影响，氢键相互作用等作用力可以影响酶的热稳定性。

a- CpCR与PAAH对接构象图；b- CpCR与PAAH对接2D构象图；c- CpCR与PAAH对接氢键相互作用图

图2  CpCR与PAAH对接构象图及氢键相互作用图

Fig. 2  Docking conformation and hydrogen bonding interaction diagrams of CpCR and PAAH

根据热力学原理，对于受体-配体（酶-底物）复合物，其自由能越低，所形成的构象越稳定。突变自由能比较（Δ ΔGmut = ΔΔGfold(mutant) - ΔΔGfold(wild type)），结合易错PCR筛选结果分别对其进行虚拟饱和突变。计算其结合突变能。

选择突变能最低的氨基酸，采用定点突变技术构建得到S50N、Q60W、A97K、L165D、T171F、P284E和L309W 7个突变体。

a-相对比酶活力；b-催化合成2-PE产率

图3  wtCpCR和7种突变体酶的相对比酶活力和转化合成2-PE的产率

Fig. 3  Relative specific ativity and 2-PE yield of wtCpCR and 7 mutants

筛选得到催化合成2-PE酶活性和产率更高的突变体T171F和L165D。据文献报道，较高的Km值意味着对底物的亲和力低，但较高的Kcat值更可取，因为生产应用中高底物负荷可以完全弥补低亲和力的不足，催化效率的衡量标准是高Kcat值而不是高Kcat/Km。

表1 不同突变株对苯乙醛的酶动力学参数及催化特性参数

Table 1  Enzyme kinetic parameters and catalytic characteristic parameters of different mutant strain for phenylacetaldehyde

酶的热稳定性改造中，在PB缓冲液中，T171F、S50N、A97K的半衰期t1/2相比wtCpCR有所提升，其中T171F的t1/2提升至28 h。T171F的半失活温度T50值为37℃，比wtCpCR提高1℃。

a-酶的半衰期；b-T50值变化

图4  wtCpCR和6种突变体酶的半衰期和T50值变化

Fig. 4  Changes oft1/2and T50 of wtCpCR and 6 mutants

结合突变酶的相对比活力、催化合成2-PE产率、催化特性参数Kcat值、以及半衰期t1/2和T50值，突变体T171F具有更强的催化能力和热稳定性，具有更好应用前景。因此，选择突变体T171F与wtCpCR进行催化合成2-PE条件研究。

结果表明，酶最适催化合成2-PE的温度为30 ℃；T171F最适pH为6.5，wtCpCR最适pH为7.0；苯乙醛浓度为1 000 mg/L时，T171F产率可达90%以上，wtCpCR则只有31.7%。而且突变体T171F相比wtCpCR催化时间由10 h降低到4 h，催化效率得到很大的提高。本研究为羰基还原酶CpCR催化合成2-苯乙醇提供重要的科学依据。

团队介绍

三峡大学绿色生物制造团队现有成员9人，其中教授2人，副教授3人，讲师4人，长期从事功能微生物育种、生物催化与转化、蛋白质分子改造及高效生物催化剂的制备、环境微生物技术等领域的研究与开发。团队致力于服务湖北生物产业，与宜昌及周边生物企业保持长期合作关系。承担国家级项目4项，省部级项目5项，横向开发项目20余项，获得湖北省科技奖励4项，授权国家发明专利15项，技术成果转化7项，出版专著5部，发表高质量论文100余篇。

团队负责人

龚大春，教授，博士生导师。三峡大学生物与制药学院生物工程学科责任教授，担任中国生物化工专业委员会委员，中国生物发酵产业协会理事，生物催化宜昌市重点实验室主任，湖北省微生物学会理事。主要研究方向为微生物育种、生物催化、发酵工艺及酶制剂研究与开发。主持完成国家自然科学基金面上项目2项，省部级项目5项，横向合作项目10余项，获省部级科技进步奖3等奖2项，技术发明奖3等奖2项，湖北省教学成果一等奖1项，出版专著5部，授权国家发明专利10余项，发表科技论文50余篇。

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