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谷氨酸棒杆菌核苷水解酶的酶学性质研究

作者：

孟燕，丁啸虎，杨文君，谢海箫，王浚哲，张成林*

单位：

天津科技大学 生物工程学院

基金项目：

国家自然科学基金项目（32170049）；国家重点研发计划（2021YFC210802）；天津市合成生物技术创新能力提升行动项目（TSBICIP-KJGG-009）；大学生创新创业计划项目（202110057132；202110057314）

摘要&关键词

摘要：核苷水解酶是一类催化核苷生成D-核糖及嘌呤或嘧啶的酶，广泛存在于除哺乳动物以外的生物中。该文表达并纯化了3个来源于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032的核苷水解酶Cgl1364、Cgl1977和Cgl2835并考察其酶学特性。酶学实验结果表明，重组Cgl1364、Cgl1977和Cgl2835均具有核苷水解酶活性；能够催化腺苷、胞苷、鸟苷、黄苷、肌苷和尿苷生成D-核糖和相应的嘌呤或嘧啶，但底物特异性有所差异；重组酶在15～55 ℃以及pH 4～10条件下均具有活性，其最适温度和pH分别为35 ℃和7.0；Cgl1977的热稳定性优于Cgl1364和Cgl2835。利用BL-cgl1364静息细胞为酶源催化水解尿苷，底物转化率达到89.5%。该研究首次报道了谷氨酸棒杆菌核苷水解酶的功能和性质，可为D-核糖、嘌呤及嘧啶的“一锅法”生物合成提供重要参考。

关键词：核苷水解酶；谷氨酸棒杆菌；核苷；D-核糖；热稳定性

主要结论

本研究首先对来源于谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC 13032的核苷水解酶Cgl1364、Cgl1977和Cgl2835进行了同源性分析，其同源性大于40%，Cgl1364与Cgl1997、Cgl2835同源性分别为54%和45%。然后于大肠杆菌（Escherich coli BL21(DE3)）表达重组酶并利用Ni-NTA亲和树脂分离纯化。酶学性质结果表明，3种重组酶均能够以腺苷、胞苷、鸟苷、黄苷、肌苷及尿苷为底物催化生成D-核糖及相应的嘌呤或嘧啶，但其底物特异性有所差异：Cgl1364对尿苷和胞苷亲和性最强，其次是黄苷、鸟苷和肌苷，对腺苷亲和性最低；Cgl1977对鸟苷和黄苷亲和性最强，其次是尿苷、胞苷和肌苷，对腺苷亲和性最低；Cgl2835对鸟苷和黄苷亲和性最强，其次是肌苷、腺苷和胞苷，对尿苷亲和性最低。重组酶最适反应温度和pH分别为35°C和7.0且具有较好的热稳定性，Cgl1977热稳定性优于Cgl1364和Cgl2835。以cgl1364构建的重组菌株BL-cgl1364静息细胞为酶源可催化水解尿苷，底物转化率为89.5%。

图1 Cgl1364、Cgl1977和Cgl2835同源性分析

Fig.1 Alignment analysis of Cgl1364, Cgl1977 and Cgl2835

图2 温度对重组酶活性的影响

Fig.2 Effect of temperature on the activities of recombinant enzymes

图3 pH对重组酶活性的影响

Fig.3 Effect of pH on the activities of recombinant enzymes

图4 重组酶的热稳定性

Fig.4 Thermal stability of the recombinant enzymes

图5 BL-cgl1364静息细胞催化过程曲线

Fig.5 Curve of uridine hydrolysis by BL-cgl1364 resting cells

团队介绍

天津科技大学代谢工程研究室（陈宁教授团队）主要致力于氨基酸、核苷及其衍生产品的高端绿色制造技术开发，形成了代谢工程育种和代谢控制发酵2个特色研究方向。在工业微生物的系统生物学分析及定向选育、发酵过程控制及产业化放大、发酵产品的分离技术开发等方面开展了开拓性的研究工作，多项研究成果在发酵行业中推广应用。

研究室现有教师9人，其中教授（研究员）4人，副教授3人，讲师2人。近年来，承担国家“863”项目、国家重点研发计划项目、国家自然科学基金项目、天津市科技支撑计划项目等国家与省部级科研项目40余项，获得科技奖励12项，发表科研论文100余篇，出版著作10部，授权国家发明专利30余项，参与制定标准20余项。

通信作者

张成林，天津科技大学生物工程学院教授，博士生导师。天津市“131”人才计划第二层次人选，中国生物发酵产业标准化技术委员会氨基酸分委会委员，天津市一流本科建设课程《代谢控制发酵》课程负责人。主要研究方向为氨基酸及其衍生物生产菌株的代谢工程选育和代谢控制发酵。近年来，承担国家与省部级及横向项目20余项，在Metabolic Engineering、Bioresource Technology等国际著名期刊发表论文20余篇；申请国家发明专利15项，授权9项，参与制定国家、行业及团体标准近20项；作为主要完成人，获得省部级科技奖励4项。

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