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聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)：分子质量因聚合度不同而异，通常在200至20000之间。分子量低于1000的为液体形态，高于1000的为固体形态，随着分子量的增加其水溶性逐渐降低。PEG最突出特性是它与各种溶剂的广泛相容性、广泛的黏度范围、保湿性、粘结性和热稳定性，而且具有低毒性、不凝血性以及生物相容性，能被机体迅速排出体外而不产生任何毒副作用等诸多优点，因此被广泛应用于医药领域多种剂型，如软膏、栓剂的基质，片剂、丸剂的载体等。
聚乙二醇（PEG）水凝胶：聚乙二醇基水凝胶展现出了广阔的应用前景,引起了人们的广泛关注。研究者们也不断提出了有关PEG水凝胶设计与合成的新思想和新方法。目前在药物控释、组织工程、生物传感等多个领域广泛得到应用。
苏黎世联邦理工学院生物力学研究所秦晓华团队成功开发了一种新型合成生物可降解微孔聚乙二醇(PEG)水凝胶，该水凝胶支持体外三维（3D）人类骨细胞网络的生成，并能够模拟早期成骨过程中的细胞-基质相互作用。为骨组织工程和疾病建模提供了一个无需动物实验的体外平台。相关内容以“Synthetic biodegradable microporous hydrogels for in vitro 3D culture of functional human bone cell networks”为题发表在《Nature Communications》上。
分别用PEG水凝胶培养第8天和第21天：
在本研究中，设计了一种合成的成孔水凝胶，用以生成3D骨细胞网络，模仿早期成骨过程中成骨细胞嵌入的过程。聚乙二醇(PEG)水凝胶是通过4臂PEG乙烯基磺酸盐(4-PEGVS)与二硫交联剂在葡聚糖和透明质酸(HA)存在下的硫醇-迈克尔加成交联形成的。聚合物诱导相分离(PIPS)是一个动态过程，其中最初可混溶的混合物（单相）在反应性组分的聚合过程中经历相分离，从而形成多相混合物。在混合组分（4-PEG-VS、HA、葡聚糖和交联剂）并升温至37°C时，混合物经历由迈克尔加成交联诱导的PIPS，并通过单一处理步骤形成具有相互连通孔隙的PEG水凝胶。HA是必需的，以增加复数粘度至适当范围（0.3–0.6 Pa s），从而防止PIPS期间相的塌陷。添加了来自纤维连接蛋白的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸肽（N-C: CGRGDSP）以促进细胞附着，而基质金属蛋白酶(MMP)敏感的二硫肽和PEG二硫醇分别用作可降解和不可降解的交联剂。
图1 聚合诱导相分离法制备微孔PEG水凝胶及其表征
人类骨髓基质细胞(hMSC)被嵌入到可被基质金属蛋白酶(MMP)降解的和不可降解的PEG水凝胶中，并在成骨条件下分化。经推断，只有当细胞能够通过MMP的蛋白水解作用重塑其周围的基质时，它们才能形成一个具有长期稳定性的相互连接的3D细胞网络。hMSC在第二天的活性在可降解和不可降解的水凝胶中都超过了80%。当嵌入到可降解的PEG水凝胶中时，hMSC不断重塑其环境，并至少维持35天的3D细胞网络。平均细胞面积的定量进一步证明了可降解水凝胶对hMSC的宽容性。可降解水凝胶中的平均细胞面积明显大于不可降解的水凝胶。在可降解的水凝胶中，在第8天形成了广泛的3D细胞网络。相比之下，不可降解的水凝胶中细胞网络形成的程度显著较少。与hMSC类似，在可降解和不可降解的水凝胶中观察到细胞形态的差异。添加细胞粘附RGD肽对人类成骨细胞(hOB)的扩散和网络形成至关重要的。研究人员发现强调了基质可降解性和孔隙结构在形成hMSC和hOB的长期稳定的3D细胞网络中的重要性。
图2 可降解和不可降解的微孔PEG水凝胶内的静态人骨细胞培养
随着成骨分化的进行，载细胞的水凝胶变得越来越不透明。因此，制备了第8天和第30天相同培养物的组织学切片，以进一步比较细胞形态、胶原蛋白分泌、基质矿化和骨钙素表达。与未切片样本类似，结果显示可降解水凝胶在第8天促进了明显的细胞网络形成，这种形成至少在30天内保持稳定，与不可降解水凝胶形成对比。在不可降解水凝胶中存在更多的绿色和黄色，对应于纤维厚度低和未成熟的胶原蛋白。相比之下，MMP可降解水凝胶中的细胞产生了更多成熟的胶原蛋白纤维（红色比例增加）。与第8天相比，第30天矿化沉积的增加意味着hMSC向更成熟的骨细胞表型的3D成骨分化。骨钙素作为成熟成骨细胞的标记物，在培养30天后主要在MMP可降解水凝胶中表达。相反，在不可降解水凝胶中观察到有限的骨钙素表达。综合这些结果表明，MMP可降解微孔PEG水凝胶对3D骨细胞网络的形成是可行的，能够实现在静态培养条件下进行随后的成骨分化。
图3 hMSC在mmp可降解和不可降解PEG水凝胶中静态培养的组织学分析
在成骨培养的第二天，与芯片外培养类似，hMSC展现出了快速扩散的显著能力，在可降解基质内形成了具有延长的树突状突起的复杂3D细胞网络。进一步研究了不同的细胞播种密度（低：5 × 105 mL-1 和 高：1 × 106 mL-1）如何影响芯片上可降解微孔PEG水凝胶中3D骨细胞网络的形成。在成骨培养基中培养7天后，高播种密度的hMSC呈现出树突状形态，积极形成复杂的3D细胞网络。相反，低播种密度的细胞看起来拉长了，但未能建立细胞间连接。
使用微孔PEG水凝胶进行了为期21天的骨芯片灌注培养。使用了具有更高渗透性（500 kDa葡聚糖）的PEG水凝胶，并根据CFD模型估计的流速，对嵌入的hMSC施加了生理平均FSS τa ≈ 2 Pa。灌注每周进行3次，每次10分钟，持续3周，以静态芯片培养作为对照。活/死染色显示，在培养的第7天和第21天，两种条件下（静态和动态）的细胞活性都很高。随着时间的推移，组间没有观察到显著差异。经大量实验证明，微孔PEG水凝胶具备在芯片上进行动态细胞培养的潜力。
图4 在PEG水凝胶内3D微流控培养hMSC
2.总结与展望
总之，作者已开发了一种合成的生物可降解微孔水凝胶，有效地支持了来自原始细胞的人类骨细胞网络的3D培养。研究了3D细胞-基质相互作用，如细胞扩散，以及对体外成骨分化的最终影响。在MMP可降解基质内，单一的骨细胞前体对多孔结构作出反应，形成3D中相互连接的细胞网络，并分化成类似骨样的组织。此外，使用这种合成非纤维状水凝胶有助于下游分析细胞分泌的基质蛋白，如I型胶原蛋白纤维，作为研究与骨形成相关的（病理）生理过程的潜在生物标记物。此外，PIPS的独特过程允许在活细胞存在的情况下形成相互连通的孔，这是通过先前描述的方法形成的其他类型的微孔水凝胶无法实现的。由此产生的渗透性允许流体通过基质流动，使其与微流体平台兼容，并有可能提供机械刺激以增强成骨作用。这个体外平台可能为以最小的动物实验依赖性研究骨发育开辟新途径。
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