论文荐读

重组地衣芽孢杆菌全细胞转化产(R)-柠苹酸的研究

作者：

沈佳颖1,2  李由然1,2  石贵阳1,2*

单位：

1. 江南大学  粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心

2. 江南大学  生物工程学院

基金项目：

国家重点研发计划项目（2020YFA0907704）；国家自然科学基金项目（32172174）

摘要&关键词

摘要：(R)-柠苹酸作为重要聚合物中间体甲基丙烯酸(Methacrylic acid，MAA)的化学合成前体，在食品加工、医疗、建筑、照明和家电等领域有着重大应用前景。(R)-柠苹酸目前主要通过化学法生产，其生物法合成技术仍处于研究阶段。该研究首次在地衣芽孢杆菌中引入异源柠苹酸合酶搭建了(R)-柠苹酸合成途径，以葡萄糖为底物实现了(R)-柠苹酸的合成与积累。进一步建立及优化了重组菌株进行全细胞转化产(R)-柠苹酸的条件，发现温度和时间可以显著影响(R)-柠苹酸的产量。最终，采用CMC培养基制备全细胞催化剂，在37 ℃、pH 7.0、底物质量浓度为100 g/L、菌体浓度OD600为70、摇床转速为250 r/min的条件下转化120 h后，生成(R)-柠苹酸8.57 g/L，转化率为142.84 mg/g葡萄糖，是目前报道的摇瓶培养合成(R)-柠苹酸的最高水平，为生物法高效合成(R)-柠苹酸的进一步研究提供了参考。

关键词：(R)-柠苹酸；异源表达；地衣芽孢杆菌；全细胞转化；柠苹酸合酶

主要结论

1. 以地衣芽孢杆菌作为底盘细胞构建了(R)-柠苹酸合成途径，通过对发酵培养基的初步优化，制备出高密度、高催化活性的全细胞催化剂，实现了柠苹酸的有效积累：重组菌株BLA于CMC培养基中进行发酵培养时，菌体生长状况最好，最终菌体浓度OD600达到29.13，柠苹酸产量可达1.94 g/L。

图1 地衣芽孢杆菌中柠苹酸合成途径

Fig.1 Biosynthesis pathway of citramalate in Bacillus licheniformis

注：cimA（柠苹酸合酶）；gltA（柠檬酸合酶）；PEP（磷酸烯醇式丙酮酸）；TCA（三羧酸循环）

a-质粒pA1图谱；b-重组质粒酶切鉴定

图2 质粒pA1图谱及酶切鉴定电泳结果

Fig.2 Construction map of plasmid pA1 and result for agarose gel electrophoresis of recombination vector

注：M-5 000 Marker；1-重组质粒pA1

图3 发酵培养基的选择

Fig.3 Selection of fermentation medium

2. 从限制细胞生长的角度出发，将重组菌BLA用作全细胞生物催化剂合成(R)-柠苹酸，通过优化全细胞转化产柠苹酸的条件，在37℃、pH 7、底物浓度为100 g/L、菌体浓度OD600为70、摇床转速为250 r/min条件下进行全细胞转化120 h，柠苹酸积累量为8.57 g/L，转化率为142.84 mg/g葡萄糖。这是目前报道的摇瓶水平细胞转化合成柠苹酸的最高产量，且没有额外添加中和剂来维持细胞生长，进一步证明了地衣芽孢杆菌凭借其高耐受性更有利于产物的合成，为生物法生产柠苹酸的研究奠定了基础。

a-菌体浓度；b-摇床转速；c-温度；d-葡萄糖浓度；e-pH；f-转化时间

图4 不同条件对柠苹酸产量及转化率的影响

Fig.4 Effects of different conditions on yield and conversion rate of citramalate

团队介绍

江南大学生物工程学院微生物发酵过程工程团队，多年来一直致力于安全型合成生物底盘细胞（地衣芽孢杆菌、酿酒酵母）；大宗发酵产品原料精细化处理技术以及发酵过程多参数在线检测和智能模拟技术的研究。在应用基础研究方面包括：（1）构建了糖代谢氧化还原平衡且阻断了甘油合成的酒精酵母细胞；（2）解析了地衣芽孢杆菌对碳源选择性利用的分子机制。在工程化研究方面包括：（1）建立重大淀粉酶品的绿色制造技术。（2）围绕柠檬酸发酵开发菌丝体适度分散技术与装备，集成细胞循环培养和分割发酵实现了生产过程的连续化，将柠檬酸发酵的产物浓度、发酵周期，平均糖酸转化率提升至世界领先水平。

近年来，在国内外学术期刊发表论文100余篇；授权专利90余项，主持国家和省部级项目15余项。除此之外，已服务企业20余家，涵盖酒精、柠檬酸、酶制剂、生物制药等行业，且10多项技术已进入中试或产业化阶段。

通信作者

石贵阳，江南大学，生物工程学院/粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，教授，博士生导师。2006年起任江南大学生物工程学院教授及微生物发酵过程工程团队负责人。主要研究方向为基于合成生物学理性设计与充分挖掘微生物细胞工厂规模化生产大宗化学品的能力。作为项目负责人承担包括863重点项目、科技支撑计划等在内的国家和部省级项目10项。以通讯作者在合成生物学与工业微生物领域权威期刊Metab. Eng.等发表SCI论文73篇；获授权发明专利42项，其中国际专利4项。获包括国家技术发明奖二等奖在内的科技奖项5项。

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