什么是细胞老化？

20世纪60年代初, 美国科学家Leonard Hayflick在体外培养细胞时发现了一种特殊的细胞生命活动状态，并将这种状态命名为细胞老化（senescence）[1,2]。一般而言, 细胞老化是指细胞失去分裂能力而发生不可逆的细胞周期阻滞的一种现象或状态。它可由多种诱导因素触发, 如染色质端粒(telomere)长度过短、外界刺激(如缺氧等)、DNA损伤和癌基因、抑癌基因的活性异常等[3]。

然而，在体外细胞培养中，细胞老化往往意味着细胞状态变差，增殖活力降低，这是在日常工作中，细胞饲养员们都不想看到的现象。接下来，就跟着小富学姐，学会发现老化细胞，并掌握预防细胞老化的实验技巧吧！

怎么发现细胞老化呢？

细胞老化的形态和分子生物学变化

1、显微镜下观察，老化的细胞通常会在细胞内部出现空泡（可能是凋亡小体）。但是，需要区分的是，部分细胞本身会有少量空泡，对于这些细胞，要每天观察，注意细胞空泡是否增多。

2、显微镜下，也可能会观察到更多的黑点，大多沿细胞周边排布，细胞内部也可能会出现一些，但相对周边为少。

3、老化以后的细胞会出现立体感慢慢消失，开始成扁平状，这是因为细胞的折光性变差，显微镜下可以直观地观察到细胞“变薄”。

4、细胞与细胞之间的间隔减小或混在一起，细胞不再是梭形，而会成为各种不规则形状。

5、如果是贴壁细胞，会发现细胞的贴壁性减弱，开始有细胞漂浮于培养液中。

6、老化的细胞，表面分泌物会增多，细胞表面的纯净度越来越低，不再保持透亮。

7、细胞的增殖速度显著降低，细胞活力变弱。

8、有些细胞在正常培养的条件下，也会开始长角，即发生了细胞分化。

9、由于细胞周期中断和DNA复制停止，老化细胞内的DNA含量与正常细胞类似，但细胞内的RNA与蛋白质丰度均比正常细胞要明显升高。这是由于，虽然细胞进入老化阶段后蛋白质的整体合成速率降低，但是蛋白质的降解体系受到更加明显的抑制，导致蛋白质在细胞内持续堆积。

老化的HS865.SK

老化的HFOB1.19

最后，需要强调的是：由于不同组织来源的细胞，其形态本就各不相同，因此目前还没有一个客观的、统一的标准从细胞形态判断并定义老化细胞。因此，在细胞培养的过程中，持续观察细胞，关注细胞的变化，是一位细胞培养员的重要工作内容。

什么是细胞老化？

防止细胞老化最主要还是要做到勤观察、勤换液、勤传代、勤保种，特别是传代，不能等细胞太密了之后传，一般细胞建议长到80％~90%融合度传代最好；

换培养液频率与培养的细胞种类直接相关，建议新手培养员在培养每一种细胞时，多参考官方资料，并多多咨询有经验的同学、技术员等，同时在实际操作的过程中积累经验，形成自己的最佳培养体系；

选择可靠且稳定的血清和培养基至关重要：血清和培养基直接为细胞提供生长所需的营养，它们直接关系到细胞的生长状况。务必挑选适宜的血清，否则由于营养成分不均衡，可能导致细胞提前老化。此外，一个稳定的培养基同样是培养细胞的关键因素。在过去的十年中，富衡实验室针对细胞库中的每一株细胞，都设计了最优化的培养体系。每株细胞都拥有其专属的完全培养基，确保了细胞的最佳状态

在培养大部分贴壁细胞时，消化步骤不可避免，但是消化对细胞的表面蛋白质有一定的破坏作用，因此不能长时间进行消化并且在选择消化酶时也要选择较为合适的pH和浓度，不然就会使细胞老化或者分化；

在着手培养细胞并进行传代的同时，及时进行细胞的冻存工作至关重要，以确保细胞种子库的持续存在，这能有效预防细胞事故导致实验室中某一株细胞绝种。尽管老化细胞不会即刻消亡，但它们的基因表达模式会经历变化，可能会对生物实验的结果产生较大影响。如果发现正在培养的细胞老化严重，建议从种子库或工作库中重新复苏细胞。

参考文献：

[1] 张聚,刘斯奇,徐宁志.细胞老化的基本特征和研究进展[J].中国细胞生物学学报,2013,35(01):1-16.

[2] Prieur A, Peeper DS. Cellular senescence in vivo: A barrier to tumorigenesis. Curr Opin Cell Biol 2008; 20(2): 150-5.

[3] Verdun RE, Karlseder J. Replication and protection of telomeres. Nature 2007; 447(7147): 924-31.