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用于移植的器官和组织的长期短缺给全世界的医疗保健系统带来了巨大的负担。虽然组织工程提供了潜在解决方案，但预血管化仍然组织工程产品体内存活和整合的关键因素。同时，阻碍此类产品临床实施的另一个挑战是它们从制造现场到床边的有效保存。

针对此问题，来自葡萄牙米尼奥大学的Sara Freitas-Ribeiro/Helena Moreira/Lucília P. da Silva/Jennifer Noro/Alexandra P. Marques/Rui L. Reis/Rogério P. Pirraco/Belém Sampaio-Marques/Paula Ludovico、葡萄牙波尔图大学医学院的Mariana Jarnalo/Ricardo Horta等人使用脂肪来源的基质血管部分细胞制造3D预血管化结构，并使用低温溶液或基础培养基保存在4 °C下。与保存前的结构相比，低温溶胶有效地保存了血管前网络的结构和细胞完整性。

相关研究成果以“Prevascularized spongy-like hydrogels maintain their angiogenic potential after prolonged hypothermic storage”为题于2024年3月28日发表在《Bioactive Materials》上。

1. RGD功能化海绵状水凝胶特性

结冷胶/结冷胶二乙烯基砜-精氨酰甘氨酰天冬氨酸（GG/GGDVS-RGD）海绵状水凝胶的制备如图1A所示，通过将GGDVS-RGD与未修饰的GG结合产生干燥的聚合物网络（图1B）。通过拉曼光谱证实了RGD肽的存在（图1C）。SEM和μ-CT显示干燥的聚合物网络具有宽的微结构和半互穿网络结构（图1D和1E）。水合后，干燥的聚合物网络形成海绵状水凝胶（图1F）。浸泡在PBS等水溶液中后，这些干燥的结构表现出快速吸水性，浸泡后仅1小时就达到饱和点（图1H）。此外，在干燥的聚合物网络中观察到的微结构和互连结构在盐溶液水合后保持完整（图1G）。达到吸水平衡（24小时）后（图1I），继续评估GGDVS-RGD海绵状水凝胶的机械性能，水凝胶表现出能够压缩高达80%的高度而不破裂（图1J）。

图1 RGD功能化海绵状水凝胶特性

2. 无外源因子下水凝胶支持SVF组织和血管前网络的形成

为了在所产生的构建体中创建血管前网络，从脂肪组织中分离SVF，接种到水凝胶上并培养14天，培养5天和10天后更换培养基（图2A）。由于血管生成和血管生成信号在脉管系统形成中至关重要，因此评估了SVF细胞在培养5、10 和14天时分泌的特定蛋白质。对于大多数分析因素来说，血管生成/血管生成相关蛋白的水平随着时间的推移而变化（图2B）。参与 ECM 重塑的因子，即uPA、PAI-1、TIMP-1、MMP-9和MMP-8的水平随着时间的推移而下降，而MCP-1、IL-8、血小板反应蛋白-1和VEGF的水平随着时间的推移而增加（图2B）。在早期时间点，内皮CD31阳性细胞显示出无组织的模式，如免疫细胞化学所示（图2C）。随着培养10天后血管生成/血管生成蛋白水平增加并稳定，血管前网络的形成变得明显，最终在第14天形成复杂且互连的网络。

图2 在没有外源性血管生成因子的情况下，海绵状水凝胶支持SVF组织和血管前网络的形成

3. 低温保存14天后，低温溶胶保留了血管前网络

接着，作者研究了将所创建的血管前网络保存一段时间的可能性，以便在其临床应用之前存储工程结构。使用HTS或α-MEM作为储存溶液，将预血管化构建体在4°C下储存14天。此后，用培养基替换储存溶液，并使构建体在生理条件下恢复24小时（图3A）。当使用α-MEM作为储存溶液时，观察到血管前网络的延伸和复杂性明显减少，同时细胞含量也减少（图3B）。节点和片段的数量显着减少，而孤立片段的数量显着增加，表明用α-MEM保存后结构不太复杂（图3C）。

相反，当HTS用作存储溶液时，所创建的血管前网络的复杂性和互连性以与BP类似的状态得以保留，CD31的表达模式证明了这一点（图3B）。对节点、连接点、网格、线段和线段长度的数量分析显示，当使用HTS进行保存时，这些值没有变化（图3C）。用HTS保存后，分枝数量和总分枝长度显着增加（图3C）。此外，使用钙黄绿素染色可以观察保存后细胞形态的重要差异。用HTS保存的细胞保持了与BP类似的纺锤形形态，表明它们保留了结构完整性。

图3 低温保存14天后，低温溶液保存了所创建的血管前网络

4. Hypothermosol保护细胞免受氧化应激，同时保留SVF分泌组谱

在评估低温对细胞形态和组织的影响后，研究低温对细胞过程的影响非常重要，特别是关注自噬和细胞凋亡。了解这些细胞反应之间的相互作用是阐明低温条件下细胞适应机制的关键的第一步（图4A）。为了研究自噬是否受到低温暴露的影响，我们使用免疫印迹测定评估了低温保存前后的自噬通量。考虑到用α-MEM保存后观察到的血管样结构减少，并考虑到先前的研究表明特定细胞类型（特别是内皮细胞和免疫细胞）对低温的脆弱性，作者的目标是更深入地了解这些细胞的状态细胞。因此对保存前和保存后的预血管化构建体的分泌组进行了分析，重点关注血管生成/血管生成和炎症细胞因子（图4E）。

图4 低温溶液保护细胞免受氧化应激，保持SVF群体异质性

5. HTS中的保存不会影响预血管化海绵状水凝胶的体内血管生成潜力

如上所述，低温保存期间血管前网络的保存至关重要。因此，使用CAM模型确定预血管化构建体在低温条件下是否保持其体内血管生成潜力。在用HTS或α-MEM保存之前和之后，将预血管化的海绵状水凝胶植入鸡蛋的CAM中4天，还植入了包含不含细胞的海绵状水凝胶的对照组（图5A）。将植入位点周围的区域固定、拍照、切除并石蜡包埋以用于血管生成评估和量化。结果显示在所有条件下宿主血管都会募集（图5B）。H&E染色的组织学分析揭示了所有组中均存在以异嗜细胞浸润为特征的免疫反应（图5D）。预血管化的海绵状水凝胶在保存之前和之后都显示出比对照组更大的宿主组织向内生长，这表明整合得到改善。

图5 保存的预血管化海绵状水凝胶保持其血管生成潜力

这些发现表明，SVF预血管化在构建体整合和植入后血管化中发挥有益作用，当使用HTS作为保存溶液时，这两种作用大多得以维持。原位杂交结果显示，植入4天后，来自SVF的人源细胞在CAM组织中持续存在（图6A）。这些细胞位于CAM组织和植入的海绵状水凝胶之间的界面处，尽管与BP状态相比数量有所减少（图6B）。使用免疫组织化学对人CD31进行的其他分析揭示了CAM 组织和植入海绵之间的界面处存在人源血管样结构（图6C）。这不仅在BP对照组中很明显，而且在HTS保存组中也很明显。

图6 保存的预血管化海绵状水凝胶保持其血管生成潜力

这项研究表明，使用HTS等专门解决方案进行低温保存可以维持细胞活力，并在工程结构中保留已建立的血管前网络，这对于植入后的体内性能至关重要。HTS的作用对于保持SVF对CAM模型中构建体整合和血管化的积极作用至关重要，包括将植入的人体细胞纳入新形成的血管。总的来说，这项研究一方面强调了SVF在改善工程构建体的体内整合和血管化方面的巨大潜力，另一方面强调了像HTS这样的定制保存解决方案的潜力，可以有效地保存SVF的潜力，减轻低温引起的细胞损伤，为TE产品运输和存储提供有效的解决方案。

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