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建立模拟活体组织和器官复杂异质性的体外模型对于增强科研人员对生物机制的理解以及开发组织工程和再生医学的新药物和疗法至关重要。传统的生物打印方法，例如基于挤出和单一材料的数字光处理（DLP）生物打印，无法捕捉自然组织复杂的机械和结构多样性。
为了解决这个问题，深圳大学的孟思副研究员和孔湉湉教授团队将多材料DLP生物打印与PEGDA-AAm（简称PA）生物墨水相结合，开发多组分、多模量、充满细胞的水凝胶结构。这些结构不仅具有异质机械性能，而且还具有复杂的结构和精确设计的表面微观结构。
相关研究成果以“Multi-Material Digital Light Processing (DLP) Bioprinting of Heterogeneous Hydrogel Constructs with Perfusable Networks”为题于2024年4月8日发表在《Advanced Functional Materials》上。
为了打印水凝胶结构，使用基于DLP的打印机来固化水凝胶前体（图1），该打印机具有波长为405 nm的LED光源，最大光强度为≈100 mW cm−2。为了配制用于DLP打印机的生物墨水，研究者将AAm和PEGDA分别作为水凝胶的软结构成分和硬结构成分来制备水凝胶前体。该配方中，苯基2,4,6-三甲基苯甲酰次膦酸锂（LAP）作为光引发剂和红色食用染料作为光吸收剂。
图1 用作模拟异质人体组织结构的体外模型的水凝胶结构的示意图
生物墨水的凝胶时间（Tgel）显着影响印刷适性。研究者将浓度分别为25、35和50 wt%的1 mL PA生物墨水样品在玻璃瓶中进行10秒的光交联。结果显示，浓度为25和35 wt%的PA生物墨水仅表现出部分凝胶化，浓度为50 wt%的PA生物墨水显示出完全凝胶化和凝固，几乎观察不到墨水流动。这表明50 wt% PA生物墨水具有更快的固化过程，使其更适合创建复杂的结构（图2A）。流变测试和模量计算也显示50%单体浓度的PA生物墨水成为增强可打印性的更有希望的候选者（图2B-C），使其成为后续实验的首选。此外，研究者优化了曝光参数、光吸收剂含量（最优比为1%）、单体浓度和PEGDA:AAm (PA)比例（比例分别为2%、5%和10%），得到可以在水环境中表现出优异结构完整性和尺寸完整性的体外模型构建支架材料（图2D-I）。细胞实验显示I型胶原蛋白表面处理后软质和硬质PA水凝胶均具有出色的生物相容性（图2J-L），可以作为支持细胞生长的基质材料具有巨大的潜力。
图2 水凝胶生物墨水的物理特性、印刷适性和细胞活力
为了展示DLP生物打印在制造具有可灌注网络的充满细胞的水凝胶结构方面的潜力，研究者创建了具有直通道和气管样通道的微流控芯片。为了验证结构内空心通道的成功打印，研究者将呈现蓝色荧光的NIH-3T3细胞注入这些通道中（图3A）。文章展示了两种不同的具有嵌入式中空结构的水凝胶结构的成功构建（图3B，E）。使用共聚焦显微镜可以观察到混合到生物墨水中的Hela-GFP细胞均匀分布在整个水凝胶中，而灌注的NIH-3T3细胞填充了中空通道，它们的蓝色荧光清晰地勾勒出这些嵌入的微通道。绿色荧光Hela-GFP细胞和蓝色荧光NIH-3T3细胞之间的明显区别，每个细胞都局限于特定区域（图3C、D、F、G），证明了构建体的高保真度。
水凝胶结构的表面拓扑在影响细胞行为方面起着至关重要的作用，因此创建具有特定表面拓扑微观结构的水凝胶结构非常重要（图3H）。为了评估这些表面拓扑微结构对细胞行为的影响，研究者设计了两种类型：螺旋槽微结构和基于三周期最小表面（TPMS）的微结构。螺旋槽微结构对于引导平滑肌细胞和间充质干细胞等细胞的方向特别有效。另一方面，TPMS以其重复、有组织的模式而闻名，可提供无中断的连续表面（图3I-P）。
图3 具有可灌注网络和工程表面形貌的载有细胞的水凝胶结构
复制肝小叶、皮肤和软骨等组织和器官固有的各种机械模量是组织工程中的一个挑战。研究者使用多材料DLP技术和多功能PA生物墨水，将具有不同机械特性的组件稳健地组装成单个体外模型。一个简单的例子是PA1和PA2水凝胶的集成，其中它们界面上的粘合是通过间隙空间中存在的未固化PA生物墨水的固化来实现的（图4A）。将两种尺寸相同但配方不同的水凝胶组合在一起可产生具有中等且平衡的机械性能的水凝胶（图4B）。一个更复杂的示例涉及在同一平面上以预先设计的图案打印PA1和PA3生物墨水并允许它们互连，PA1水凝胶有效地支持了PA3水凝胶的拉伸，并且它们的界面没有出现任何破裂或分离（图4C）。
为了证明多材料DLP在制造生物相关异质组织模型方面的能力，研究者开发了一个简化的肝小叶模型（图4D），利用蓝色PA1和红色PA3生物墨水分别代表肝窦和肝板。打印后捕获的光学图像清楚地定义了蓝色和红色水凝胶之间的边界，它们具有不同的机械模量（图4E）。此外，荧光显微镜显示NIH-3T3和Hela-GFP细胞均匀分布在其指定的水凝胶区域内（图4F），有效地实现了多材料结构内多种细胞类型的区域特异性封装。多组分模型的成功创建说明了该方法在研究水凝胶材料内细胞相互作用的潜力。此外，研究者还将异质性的探索扩展到了Z轴，证明了沿z轴构建异质结构的可行性（图4G-M）。
图4 充满细胞的多材料异质水凝胶结构
综上，本文演示了充满细胞的水凝胶微流体装置的制造，并探索表面拓扑（包括螺旋槽和三周期最小表面）如何指导细胞行为。这种方法为体外复制组织和器官结构开辟了新途径。复合水凝胶和双网络水凝胶的进步及其通过多材料DLP生物打印实现的精确结构复制能力的整合，可以在精确模拟骨组织的结构复杂性和机械行为方面取得重大进展。除了作为体外模型的应用之外，本研究还扩展了对血管组织工程和再生医学的见解，特别强调了这些生物打印材料用作植入物的前景
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