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来自上海交通大学医学院的Jiahui Du，Yili Liu，Xiaolin Wu，Mingliang Zhou以及Xinquan Jiang等多名研究人员在Nature Communications期刊（IF=16.6）上，共同发表了题为“BRD9-mediated chromatin remodeling suppresses osteoclastogenesis through negative feedback mechanism”的文章，在该文章中，研究人员使用了购自AbMole的JQ1（M2167）和Zoledronic Acid（M5032）两种产品，揭示了BRD9通过IFN-β信号介导的染色质重塑，对破骨细胞生成的负反馈调控机制，以及其应用于骨病研究的潜力。

含溴结构域蛋白9（BRD9）是非经典BAF染色质重塑复合物的一个组成部分，在髓系决定和巨噬细胞炎症反应过程中至关重要。且破骨细胞起源于髓系，与造血系中的巨噬细胞有着共同的来源。但是目前对于BRD9在破骨细胞生成和骨病中的作用机制的了解仍然有限。

研究人员用M-CSF和RANKL培养BMDMs，发现在破骨细胞生成过程中，RANKL处理后BRD9的表达逐渐上调（图1A-B）。随后通过特异性地删除BRD9来构建基因敲除小鼠（LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠）模型（图1C）。μCT分析和组织学染色（图1D-E）结果显示，与对照组小鼠相比，LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠股骨骨小梁的骨量减少，矿化度下降。

图1A. 在RANKL诱导后的指定天数，BMDMs中Brd9 mRNA的表达（通过qPCR测量）。B. 在RANKL诱导后的指定天数，BMDMs中的BRD9、MMP9、CTSK和ACP5蛋白表达。C. LysM表达系中的Brd9缺失图解。将带有包含Brd9外显子6-外显子7的loxP位点（Brd9fl/fl）的小鼠与表达由溶菌酶M启动子驱动的Cre重组酶（LysM-Cre）的小鼠杂交。D. 4周龄LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠和同窝对照小鼠股骨的H&E染色。星号表示骨量减少。E. 4周龄LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠和同窝对照小鼠股骨的Von Kossa染色。星号表示骨矿化减少。

进一步研究发现，突变体小鼠股骨骨面上来自LysM+髓系的螯合蛋白酶K（CTSK）+破骨细胞的细胞数量明显增加，且虽然LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠和对照小鼠的成骨活性相当，但前者骨表面的侵蚀程度更高（图2），说明Brd9消减后破骨细胞的谱系分化增强，骨吸收加快，从而导致骨量过度流失。

图 2 LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠和同窝对照组小鼠4周龄时钙素/茜素红S（ARS）标记的可视化。星号表示侵蚀的骨表面。白色虚线勾勒出股骨远端生长板。

然后通过给小鼠的BMDMs注射RANKL，在体外诱导破骨细胞分化。研究人员发现，在RANKL诱导后，使用BRD9的抑制剂iBRD9处理的BMDMs中，破骨细胞特异性基因的表达增加（图3A）。而在没有RANKL诱导的情况下，iBRD9对破骨细胞生成没有明显影响，表明BRD9的功能依赖于RANKL（图3B-C）。且RANKL处理后上调的BRD9以负反馈机制，抑制RANKL诱导的破骨细胞分化。

图 3 A. 使用qPCR检测在RANKL诱导的BMDMs中加入不同浓度的iBRD9一天后，Acp5和Mmp9的mRNA表达情况。B. 用WB测定用或不用RANKL诱导的1 μM iBRD9或载体处理3天后，BMDMs中FOS和CTSK的蛋白表达。M-CSF，M；RANKL，R。C. 通过qPCR测量，在1 μM iBRD9或载体处理3天后，无论有无RANKL诱导，BMDMs中Acp5和Mmp9的mRNA表达。

此外，研究人员发现，经iBRD9处理后，RANKL诱导的BMDMs中IFN-β信号活性下调（图4A）。且在抑制BRD9的BMDMs中加入IFN-β1细胞因子后，可以抑制破骨细胞的生成（图4B），提示BMDMs中IFN-β信号转导的转录激活可能有助于BRD9介导的破骨细胞生成过程中的负反馈调节。

图 4 A. MR+iBRD9组和对照组的GSEA图和聚类热图。B. 通过qPCR测量在破骨细胞诱导过程中，用1 μM iBRD9和0.0625 ng/ml IFN-β1处理2天的BMDMs中Acp5和Mmp9的mRNA表达。

随后，通过免疫沉淀（ChIP）测序，基因KEGG富集以及蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，研究人员发现STAT1是相互作用最多的枢纽基因之一，同时也是IFN-β信号活动的主要介质（图5A-C）。且据观察，Stat1缺陷小鼠的骨中存在过度的破骨细胞生成，表明其对破骨细胞分化具有负调控作用。进一步研究发现，Stat1表达下调可能是BRD9抑制破骨细胞过度生成的一个关键过程。

图 5 A. 使用WB测量破骨细胞分化后不同时间下，BMDMs中IFN-β、STAT2和STAT1的蛋白表达。B. 4周龄小鼠股骨远端STAT1(红色)和CTSK(绿色)的免疫荧光染色。C. RANKL诱导3天后BMDMs中STAT1(绿色)、TRAP染色(红色)和肌动蛋白(红色)的免疫荧光。

接下来研究人员将预测的Stat1近端启动子和增强子克隆到载体中进行实验，发现抑制BRD9能明显降低Stat1启动子和增强子的转录活性（图6A）。且ChIP-qPCR结果显示，BRD9可以直接与Stat1的启动子和增强子结合（图6B）。说明BRD9能通过直接调节Stat1的启动子和增强子活性从而促进Stat1的转录。

图 6 A. 在用iBRD9或对照载体处理的破骨细胞诱导的RAW264.7中，Stat1启动子单独或在增强子区域存在下的荧光素酶报告子活性。B. 破骨细胞诱导过程中，RAW264.7细胞系BRD9抗体(或IgG)的芯片分析。

随后，通过分析ATAC-seq数据(图7A)以及基因组中共定位情况，选择转录因子FOXP1进行研究。免疫共沉淀(IP)分析证实，在破骨细胞分化期间，BMDMs中BRD9和FOXP1之间存在物理相互作用(图7B)。ChIP-qPCR结果显示，FOXP1可以直接与Stat1的启动子和增强子结合，但在抑制BRD9后FOXP1与Stat1的结合功能会受到影响（图7C）。提示FOXP1是BRD9在Stat1转录激活和破骨细胞分化过程中进行负反馈调节的关键辅助因子之一（图7D）。

图 7 A. 抑制BRD9后DAR基序富集损失的点气泡图。B. 在破骨细胞诱导过程中用FOXP1抗体(或IgG)在BMDMs中进行Co-IP分析，随后用BRD9和FOXP1进行免疫印迹。C. 用 iBRD9 或载体处理 RANKL 诱导过程中的 RAW264.7 细胞，对FOXP1抗体（或IgG）进行ChIP检测。D. BRD9介导的染色质重塑。

之后研究人员通过比较BRD9和BRD4被抑制后的转录谱，探索BRD9与BRD4的功能特异性，发现两者的功能特异性主要存在于细胞周期和破骨细胞分化过程。

随后又以脂多糖（LPS）诱导的牙槽骨损伤为模型进行实验，发现Brd9缺失小鼠对牙槽骨的局部急性损伤（图8A-B）和破骨细胞活性（图8C-D）具有抗性。且含有BRD9降解剂的改良可注射光固化SF（图8E）可以降低破骨细胞活性（图8F-G）以及LPS/ligation刺激的急性局部骨质流失（图8H-I）等指标。说明在感染刺激情况下，BRD9的缺失或降解在骨组织中的抗炎作用可能比在基础条件下更为明显。

图 8A-B. 4周龄LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠（n=4）和同窝对照小鼠（n=9）上颌骨中LPS诱导的局部牙槽骨损失的μCT成像（A）和量化（B）。C-D. 4周龄LysM-Cre;Brd9fl/fl小鼠（n=3）和同窝对照小鼠（n=4）经LPS刺激上颌骨的TRAP染色（C）和量化（D）。E. dBRD9降解剂处理示意图。F-G. 对6周龄小鼠上颌骨BRD9降解剂处理侧和对照侧，经LPS诱导的局部牙槽骨进行TRAP染色(F)以及量化(G)。H-I. 对6周龄小鼠上颌骨BRD9降解剂处理侧（右侧）和对照侧（左侧）经LPS诱导的局部牙槽骨损失进行μCT成像(H)和量化(I)。

该研究使用了购自AbMole的JQ1(M2167)和Zoledronic Acid(M5032)两种产品。其中JQ1是BRD4的抑制剂，Zoledronic Acid是一种可以抑制破骨细胞骨吸收，以及破骨细胞分化相关分子表达的化合物。

实验中使用JQ1抑制BRD4，并与BRD9被dBRD9降解后的转录谱相比较。发现两组差异最明显的是细胞周期和破骨细胞分化过程。并且细胞周期相关的特征基因在JQ1组明显下调（图9），提示其在破骨细胞生成过程中的潜在作用导致了dBRD9和JQ1的相反效应。

图 9 破骨细胞形成过程中JQ1处理组与dBRD9处理组细胞周期相关信号基因的热图。

研究人员通过使用Zoledronic Acid建立颌骨坏死（ONJ）小鼠模型，并发明一种含有BRD9降解剂的改良型可注射光固化蚕丝纤维素（SF），在拔牙后立即填充到牙槽骨窝中。通过μCT成像评估显示，ONJ-dBRD9组小鼠的臼齿拔除窝内充满了组织良好的新形成的骨小梁（图10A），且骨坏死和骨膜反应的发生率比ONJ-对照载体组的小鼠降低80%（图10B）。表明应用dBRD9研究Zoledronic Acid诱导的ONJ是一种有前景的策略。

图 10 A. dBRD9降解剂处理组和对照组小鼠上颌骨的μCT成像。黄色箭头1表示严重的骨膜反应。黄色箭头2表示骨质疏松的上颌窦底。黄色箭头3表示骨硬化和死骨。星号表示骨量不足。B. dBRD9降解剂处理组和对照组小鼠上颌骨骨坏死和骨膜反应的发生率。

综上所述，研究人员揭示了BRD9-FOXP1-STAT1轴在破骨细胞负反馈途径中的重要作用，进一步拓展对染色质重塑因子、转录因子以及信号通路之间互作网络的认识，为开发破骨细胞相关骨病的研究策略提供了启示。

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鸣谢：Du J, Liu Y, Wu X, et al. Nat Commun. 2023 Mar 14;14(1):1413.