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骨缺损常见于严重创伤、感染或手术切除骨肿瘤的患者。虽然骨骼具有一定的自愈能力，但当缺陷超过机体的自愈能力时，需要手术干预。但目前仍存在供体来源不足、供区疼痛、神经损伤、再发骨折等问题，限制了其应用。
鉴于此，四川大学周宗科、李乙文和罗泽宇等人成功地制备了一种无机-有机多功能复合水凝胶(PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs)，通过增强成骨和血管生成以及抑制破骨细胞生成来协同治疗骨缺损。该内容以“A Composite Hydrogel Functionalized by Borosilicate Bioactive Glasses and VEGF for Critical-Size Bone Regeneration”为题发表于《Advanced science》上。
1.主要内容：
Sr-BGNPs是在多组分70SiO2-10B2O3-14CaO-6SrO体系中采用溶胶-凝胶法合成的，Sr-BGNPs具有良好的单分散性，呈近似规则的球形，表面呈粗糙的中空介孔结构，粒径范围为70~100nm，带负电荷的BGNPs可以增强成骨细胞的黏附、增殖和成骨分化。
图1 Sr-BGNPs的制备与表征
为了进一步评估掺入Sr-BGNPs对复合水凝胶的储存(G’)和损耗(G″)模量的影响，我们测试了Sr-BGNPs含量为1、3、5、8和10%(w/v)的复合水凝胶的成凝胶动力学、剪切应变和频率扫描。当Sr-BGNPs掺入量大于5%时，G′随Sr-BGNPs浓度的增加而降低，凝胶完整性降低，机械强度迅速下降，这与凝胶形成动力学的结果一致。
图2 PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs水凝胶的制备及性能研究
Sr2+和BG均能促进rBMSCs成骨分化。ALP可在早期检测细胞成骨分化，茜素红染色(ARS)可在分化晚期检测细胞矿化首先将rBMSCs与5组细胞在成骨诱导液中共培养7d，进行ALP染色，并使用ImageJ软件定量分析阳性面积百分比。与其他4组相比，PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组rBMSCs中ALP的表达显著增加，且PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组的阳性面积百分比最大。将rBMSCs与5组细胞在成骨诱导培养基中共培养14d后，ARS检测钙沉积情况。与其他4组相比，PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组rBMSCs的钙沉积显著增加，且阳性面积百分比最大。将rBMSCs与5组细胞在成骨诱导培养基中共培养14d，采用免疫荧光染色法检测成骨相关蛋白(BMP-2、RUNX2、COLI)的相对表达量。PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs显著上调BMP-2，RUNX2和COLI蛋白水平。将rBMSCs与5组细胞在成骨诱导培养基中共培养14d,RT-PCR检测成骨相关基因(BMP-2、RUNX2、ALP)的相对表达量。PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs显著上调BMP-2，RUNX2和ALP基因水平。以上结果表明，PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs水凝胶在体外促进rBMSCs成骨分化。
图3 PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs水凝胶的体外成骨分化研究
Sr2+可抑制破骨细胞分化，上调骨保护素(OPG)的表达，从而抑制破骨细胞分化和成熟，其原理是OPG抑制RANKL与RANK的结合，抑制下游NF-KB1/ERK1/2和MAPK/ERK1/2介导的NFATc1转录，从而抑制破骨细胞的形成锶掺杂BG通过抑制Raw264.7细胞p38和NFxB信号通路抑制成骨分化。此外，环境的酸碱度影响破骨细胞的活性。PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs通过将释放的BO33-和SiO44-与环境中的H+结合，减缓Sr2+的释放，构建碱性微环境。因此，PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs可以抑制破骨细胞的分化和成熟。在50ngmL-1RANKL诱导5天后，阳性空白组中出现了破骨细胞，并显示出大量的融合细胞与几个胞内核。定量分析显示，与阳性空白组相比，PLG-g-TA/Sr-BGNPs和PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs水凝胶显著抑制了RANKL诱导的Raw264.7细胞成骨分化，表现为成骨细胞的大小和数量减少(p<0.0001)。阴性空白组保留牛骨片原有的纹理结构。阳性空白组牛骨片在RANKL诱导10d后纹理破坏，部分骨表面破坏，边缘出现不规则半透明的空洞。而PLG-g-TA/SrBGNPs组和PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组骨破坏程度较其他阳性组轻，表明负载Sr-BGNPs的复合水凝胶具有更强的抑制破骨细胞骨吸收的能力。RT-PCR的结果显示，在RANKL诱导5天后，阴性空白组仅表达了极少量的Trap(ACP5)、NFATc1、c-Fos和MMP9mRNA，而阳性空白组中上述4个基因的相对RNA表达量显著大于阴性空白组(p<0.0001)。然而，与阳性空白组相比，PLG-g-TA/Sr-BGNPs组和PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组的RNA相对表达量显著降低，这表明负载Sr-BGNPs的复合水凝胶有效地抑制了与成骨细胞分化和成熟相关基因的表达。以上结果表明，PLGg-TA/VEGF/Sr-BGNPs在体外抑制RANKL诱导的Raw264.7细胞成骨分化和骨吸收。
图4 体外抑制破骨细胞分化和骨吸收
鉴于PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs复合水凝胶在体外具有增强的成骨和血管生成性能，我们进一步创建了直径为5mm的SD大鼠颅骨缺损模型，以评估复合水凝胶的体内骨再生能力。术后8周，PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组和PLG-g-TA/Sr-BGNPs组的骨再生量均显著大于空白组和PLG-g-TA组。PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组的骨缺损几乎全部被新生骨占据。各组缺损修复能力依次为PLG-gTA/VEGF/Sr-BGNPs>PLG-g-TA/Sr-BGNPs>PLG-g-TA/VEGF>PLG-g-TA>空白。通过计算骨体积/组织体积(BV/TV)、骨密度(BMD)、骨小梁数量(Tb.N)、骨小梁分离度(Tb.Sp)、骨小梁厚度(Tb.Th)定量分析颅骨缺损处新生骨的再生情况。与其他4组相比，PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组的BV/TV最高(p<0.05)。同样，4个水凝胶组的新骨BMD均大于空白组。从水凝胶的SEM图像中可以看出，填充缺陷部位的水凝胶多孔有序的内部结构为细胞募集、黏附和向缺陷部位内部生长提供了良好的空间支撑;因此，新骨质量更高，骨密度更大。此外，Sr-BGNPs除了实现原位矿化外，还通过释放功能离子进一步促进细胞增殖和成骨分化，并促进BMD的增加。与空白组相比，PLG-gTA/VEGF/Sr-BGNPs组的协同治疗效果最好，可提高BV/TV、BMD、Tb.N和Tb.Th。降低Tb.Sp，反映新生骨结构更致密，能明显抵抗外力。
图5 不同水凝胶在大鼠颅骨缺损模型中的体内骨再生评价
水凝胶植入后8周，HE染色和Masson三色染色显示，PLG-g-TA/SrBGNPs组和PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组的骨缺损区域被新生骨组织填充，而空白组的骨缺损区域中心仅被少量稀疏的纤维组织填充。空白组缺损边缘局部高倍镜下可见少量新生骨，其中包含少量血管。值得注意的是，PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组除了存在许多成熟完整的新骨外，在未降解的水凝胶边缘也观察到新骨，部分成熟骨的中心还存在少量水凝胶。我们可以得出结论，新骨主要来源于水凝胶的边缘，并逐步向中心发展以取代水凝胶，直到水凝胶降解并形成新骨，所有的新骨都成为骨组织。此外，水凝胶植入8周后，大鼠心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏的HE染色显示在体内无系统性毒性，表明PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs水凝胶可能是一种适合骨再生的安全治疗材料。TRAP染色可见破骨细胞，细胞体积大，胞质深染，核数不等。术后8周，各组TRAP染色结果发现，空白组新生骨边缘Trap阳性(Trap+)破骨细胞极少，而各水凝胶组破骨细胞主要分布在与水凝胶和骨相邻的界面。定量分析证实PLG-g-TA组和PLG-g-TA/VGEF组有更多的Trap+破骨细胞，两组间的破骨细胞数量差异无统计学意义(p>0.05)。然而，PLG-g-TA/Sr-BGNPs组和PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组的Trap+破骨细胞显著少于PLG-g-TA组和PLG-g-TA/VEGF组(p<0.0001)。此外，PLG-g-TA/Sr-BGNPs和PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组的Trap+面积百分比均显著低于PLG-g-TA和PLGg-TA/VEGF组(p<0.0001)，表明负载Sr-BGNPs的复合水凝胶具有较强的破骨抑制能力，这与体外实验结果一致。BMP2和RUNX2蛋白标记的免疫荧光染色，定量分析证实，水凝胶处理组表达BMP-2和RUNX2蛋白标志物的阳性细胞平均百分比大于空白组(p<0.05)。其中PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs组阳性细胞百分比最高，表明PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs复合水凝胶具有最强大的成骨能力。血小板内皮细胞黏附分子-1(CD31)的蛋白标记物免疫荧光染色定量分析也证实，与空白组相比，水凝胶处理组中CD31标记的具有明显管腔结构的血管数量更多(p<0.05)。PLG-gTA/VEGF/Sr-BGNPs组的平均血管数量最多，表明PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs复合水凝胶具有最强大的血管生成能力。
图6 体内骨形成评估
2.全文总结：
该研究制备了一种负载了Sr-BGNPs和VEGF的无机-有机多功能复合水凝（PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs）。PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs水凝胶可在原位生物矿化，并减缓功能离子和因子的释放，从而促进骨生成和血管生成。血管内皮生长因子的负载有效地促进了血管化组织工程骨移植物的构建。PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs水凝胶还能促进rBMSCs的增殖、迁移和成骨分化；促进HUVECs分化形成血管；抑制破骨细胞的分化及其骨吸收能力，从而协同加速缺损部位骨组织的原位再生。总之，PLG-g-TA/VEGF/Sr-BGNPs水凝胶也是一种很有前景的人工可再生骨移植生物材料。
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