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研究背景

Background

细胞是生命的基本单位，而蛋白质则是细胞中最为丰富且功能多样的分子。它们存在于不同的细胞器中，并参与着细胞的各种生命活动。当细胞发生病变时，蛋白质的表达或活性往往会受到影响，因此，对细胞器中蛋白质的分析对于疾病的诊断和治疗至关重要。

目前，最常用的蛋白质检测技术是基于抗体识别，例如免疫印迹、免疫组化和酶联免疫吸附测定等。这些技术依赖于荧光标记抗体，通过抗体与蛋白质的特异性结合来输出信号。然而，荧光标记抗体在活细胞分析中存在一些局限性。 首先，传统抗体的分子量较大，难以穿过细胞膜，更不用说进入细胞器了。其次， 抗体的化学修饰需要使用特定的基团，例如半胱氨酸的硫醇基团和赖氨酸的氨基，可能导致修饰位点不可控，从而影响抗体的活性。再者，荧光标记抗体一般缺乏通用性， 针对不同的蛋白质目标，需要设计不同的荧光标记抗体。

研究目的

Objectives

开发一种基于荧光肽偶联探针（PCPs）的活细胞蛋白分析通用平台，针对不同细胞器中的蛋白质进行检测，为活细胞蛋白分析提供了一种新的策略，应用于疾病诊断和治疗方法的开发。

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研究亮点

构建基于荧光肽偶联探针（PCPs）的活细胞蛋白分析通用平台。

1、荧光分子骨架：

选择四苯乙烯（TPE）衍生物分子作为核心单元，其具有两个不同的功能端基，既可以作为连接识别单元和靶向单元的分子支架，又可以作为分子转子，通过限制其旋转来恢复荧光信号。

2、亚细胞器靶向单元：

小分子配体TO，通过氨基和羧基之间的缩合反应连接到TPE核心的另一侧。

3、细胞穿透和蛋白识别单元：

优化的肽序列TP，通过迈克尔加成反应连接到TPE核心上。

4、通用分析平台的检测原理：

当 PCPs 进入细胞并靶向特定的细胞器后，其细胞穿透和蛋白识别单元 (TP) 会与目标蛋白质发生特异性结合，从而限制 TPE 骨架的旋转。TPE 骨架旋转受限后，其非辐射跃迁过程被抑制，导致荧光信号增强。此外， PCPs 与目标蛋白质结合后，可能会引起 TPE 骨架构象的变化，从而影响其荧光发射性能，导致荧光信号增强。通过替换识别序列和靶向单元，即可应用于不同蛋白质的检测。（图1）

图1 通用分析平台PCPs的设计策略

研究方法

Methods

1、PCPs的设计与合成：

选择TPE衍生物分子作为核心单元，并设计合成基于肽序列TP的细胞穿透和蛋白识别单元以及基于小分子配体TO的亚细胞器靶向单元，最终构建成PCPs。

2、PCPs的光物理性质研究：

通过吸收光谱和荧光光谱等手段，研究PCPs的光物理性质，例如荧光强度、荧光寿命和荧光偏振等。

3、PCPs的蛋白识别能力研究：

通过荧光滴定实验、荧光偏振实验和分子对接等手段，研究PCPs与目标蛋白质的结合强度和特异性。

4、PCPs的细胞穿透能力研究：

通过细胞共聚焦显微镜观察，研究PCPs进入细胞的能力。

5、PCPs的细胞器靶向能力研究：

通过细胞共聚焦显微镜观察，研究PCPs在细胞中的定位情况。

6、PCPs的活细胞成像研究：

通过细胞共聚焦显微镜观察，研究PCPs在活细胞中对目标蛋白质的特异性成像。

7、空间蛋白质组学分析：

利用多个PCPs对不同的细胞亚型进行成像，并分析其荧光响应，以识别不同细胞亚型的特征。

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1.PCPs具有优异的光物理性质

PCPs在溶液中表现出明显的荧光发射，并且其荧光强度随着甘油浓度的增加而显著增强，表明其属于转子型荧光探针（图2）。

2.PCPs具有高灵敏度和选择性

PCPs能够特异性地与目标蛋白质结合，并产生明显的荧光信号增强，而对其他蛋白质或小分子没有响应（图2）。

图2 用于GRP78蛋白检测的PCP的合成和光谱表征结果

3.PCPs能够有效地靶向特定的细胞器

PCPs能够在活细胞中特异性地定位到目标细胞器，并实现对目标蛋白质的特异性成像（图3）。

图3 PCP用于活细胞中线粒体和高尔基体相关蛋白检测

4.PCPs可以进行空间蛋白质组学分析

通过分析多个PCPs的荧光响应，可以识别不同细胞亚型的特征，例如肝癌细胞亚型（图4）。

图4 PCPs在不同细胞系中用于空间蛋白质组学成像和分析

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研究局限性

目前只针对有限数量的蛋白质进行了研究，需要进一步扩展其应用范围。而且，需要进一步优化PCPs的设计，以提高其稳定性，水溶性和生物相容性。

总结

Summary

该研究开发了一种基于荧光肽偶联探针的通用活细胞蛋白分析平台，该平台具有简单易用、高灵敏度和选择性等优点，并可进行空间蛋白质组学分析。该平台的开发为活细胞蛋白分析提供了一种新的策略，并有望在疾病诊断和治疗方面发挥重要作用。

参考文献

[1] Xia Wu, Jing-Jing Hu, Chong Duan, Rui Liu, Fan Xia, and Xiaoding Lou, A Universal and Programmable Platform based on Fluorescent Peptide-Conjugated Probes for Detection of Proteins in Organelles of Living Cells, Angew. Chem. Int. Ed. 2024, 63, e202400766

PROFILE

娄筱叮

中国地质大学(武汉)，材料与化学学院，教授

目前研究兴趣：有机光电材料在化学生物传感器中的应用。

END

文案 | 陆细刚

排版 | 陆细刚、姜笑南

审核 | 陆细刚

发布｜姜笑南

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