免疫治疗已经成为目前癌症治疗中最有价值的方向之一。肿瘤细胞由于突变产生的新生抗原（neoantigen）或者表达/剪接异常产生的胚系肿瘤抗原（germline cancer antigen）可以招募大量的免疫细胞到肿瘤组织中，最重要的是肿瘤浸润的淋巴细胞（TIL， tumor infil trating lymphocytes）。这些 TIL 由于自身或肿瘤微环境中免疫检查点的异常表达，失去了杀伤肿瘤细胞的能力（耗竭）。因此免疫治疗的主要手段就是使用抗体/药物阻断免疫检 查点，从而重新激活耗竭的 T 淋巴细胞，实现对癌细胞的杀伤。2018 年诺贝尔生理或医学奖颁给了免疫检查点（PD-1 和 CTLA-4）的发现，目前这 2 个免疫检查点的抑制剂在临床上已得到了广泛的应用。但是目前发现免疫治疗的临床差异很大，不同癌症、同一癌症的不同患者表现出来的疗效差异很大，这说明了肿瘤免疫微环境的复杂性。因此鉴定新的免疫检查 点，对癌症免疫治疗就显得至关重要。

(https://www.nature.com/articles/nrc3239)

本文就是通过大数据的分析，鉴定了一个新的 T 细胞抑制性受体 PAC1（DUSP2），并对其作用机制进行了系统的研究。让我们一起来看一下作者是如何设计的。

1、目标基因筛选和功能验证

为了寻找新的抑制性受体，作者在TCGA数据库中对肝细胞癌的表达数据进行了分析，鉴定与已知的抑制性受体表达高度相关的基因。

1.结果发现PAC1与已知的抑制性受体的表达高度相关（下图AB）。

2. 作者进一步在结肠癌患者中对PAC1的表达情况进行了分析，发现和肝细胞癌中一样，该基因与已知抑制性受体PDC1和HAVCR2具有相同的表达模式，并且该基因的表达在癌组织和正常组织间的表达没有显著差异，但在外周血单核细胞和 TIL 中的表达显著上调（下图 C）。

上述结果表明PAC1可能是TIL中T淋巴细胞耗竭的一个重要基因。因此作者对PAC1对T细胞的功能的影响进行了研究。

1. 细胞实验：

作者构建了野生型及2个磷酸酶活性缺失的突变体的表达载体，并在Jurkat细胞（白血病T细胞系）中稳定表达；进而使用PMA和Ionomycin联合（PI）刺激激活T细胞功能（产生IL2、GZMB等），发现：过表达野生型及突变体，都可以阻止T细胞的激活，这表明PAC1 可以抑制 T 细胞的激活，且不依赖于其磷酸酶活性。

2. 动物实验

作者构建了PAC1敲除（Pac1–/–）小鼠并使用CD3抗体和CD28抗体活化T细胞，发现： 与野生型小鼠比较，PAC1-/-小鼠在CD3CD28处理之后，T细胞中GZMB、IFN-γ和TNF表达显著上调，表明PAC1的敲除促进了T细胞的激活。

以上的细胞和动物实验结果表明，PAC1 是一个抑制性受体，可以阻碍 T 细胞激活。既然 PAC1 能够抑制 T 细胞的激活，那么这个效应是否能影响宿主抗肿瘤免疫呢？

作者使用 AOM-DSS（乙氧基甲烷和葡聚糖硫酸钠）模型诱发小鼠结肠癌，并鉴定 PAC1 在此过程中的作用。结果表明：

1. PAC1敲除后，无论是肿瘤负荷、多样性还是肿瘤大小都出现了显著的降低（下图B），表明PAC1的缺失抑制了肿瘤发生；

2. 在野生型小鼠中可见中度分化的结肠腺癌，而Pac1–/–小鼠中只观测到明显的黏膜病变，并伴有明显的淋巴细胞浸润（下图C）；

3. 作者在乳腺癌小鼠模型（下图D）、黑色素瘤小鼠模型中进行了相同的检测，都有相同的发现。

这些结果表明：PAC1 作为 T 细胞检查点，减弱 CD8+ T 细胞介导的抗肿瘤免疫力。那么，肿瘤组织中浸润的 T 淋巴细胞（TIL）为什么会维持高水平的 PAC1 表达呢？

2、PAC1 调控 T 细胞机制研究

作者认为是肿瘤微环境导致的TIL中PAC1的高表达，因此作者测试了肿瘤微环境的各种特征性的因素包括炎症因子、缺氧、内质网应激、氧化应激和饥饿等对TIL中PAC1表达的影响，发现H2O2诱导的氧化应激特异性激活T细胞中Pac1的表达，说明ROS可能是诱导PAC1 表达的因素。

1. 作者通过Cl13病毒慢性感染诱导全身ROS产生，再检测PAC1的表达，发现CI13感染可以显著提高PAC1的表达；

2. 为了研究ROS是如何诱导PAC1表达的，作者构建了PAC1不同长度启动子的荧光素酶报告系统，发现转录起始位点上游90-720bp都可以有效响应H2O2（图e）；

3.  通过对上述区域进行序列预测，发现在转录起始位点上还有 90-100 区域存在一个保守的 EGR 结合位点（图 f），通过构建该结合位点以及突变的荧光素酶报告系统，作者发现该 PAC1 的确通过该 motif 受 EGR 调控。

EGR 是一个 ROS 敏感的转录因子。上述结果表明，ROS 可通过 EGR 诱导 PAC1 的表达。为了验证这个调控是否存在，作者使用上面的 CI13 病毒系统在小鼠体内诱导 ROS 产生，然后比较了 PAC1-/-和 WT 小鼠的 T 细胞的差异。结果表明：

1. PAC1缺失后，表达TNF和IFN-γ的T细胞数目较野生型小鼠有显著提高，说明PAC1在ROS过程中抑制了T细胞的激活；

2. 和前期的报道一致，病毒相关T细胞表达高水平的抑制性受体如PD-1、TIM3、LAG3等。但PAC1缺失之后，这些抑制性受体在病毒相关T细胞中的表达急剧下降，而激活性受体如CD127等表达大幅上升。

上述结果表明ROS的确可以通过激活PAC1的表达，从而抑制T细胞的功能。那么PAC1又是通过什么机制，调控T细胞功能的呢？

3、PAC1 调控机制的研究

1.作者首先对PAC1的亚细胞定位进行了研究，发现PAC1定位在细胞核中，而且和染色质结合在一起（下图B）。

2. 该定位是依赖其N端具有核酸结合活性的UBR（unstructuredbasicregion)，对UBR 进行突变后，PAC1的亚细胞定位从细胞核转移到了细胞质中（下图E）。

3. 继续使用 PMA 和 Ionomycin 联合（PI）刺激激活 T 细胞功能（产生 IL2、GZMB 等），发现：过表达野生型及磷酸酶活性突变体，都可以阻止 T 细胞的激活，但 UBR 突变体则无法抑制 T 细胞的激活（下图 F)。

这些结果表明，PAC1 通过其 N 端 UBR 在染色质上的定位，是其发挥功能的核心。在染色质上发挥功能，最可能的调控机制自然是表观调控了。但是表观调控有很多类型，PAC1 究竟是通过与哪个表观修饰因子互作，调控哪些表观修饰呢？

1. 作者首先对PAC1进行了免疫共沉淀co-IP-MS以鉴定与PAC1互作的蛋白，发现核小体重塑脱乙酰酶复合物（NuRD）的2个核心乙酰化酶HDAC1和HDAC2均与其有结合，并通过co-IP-WB验证了这些结合是存在的（下图AB）；

2. PAC1与NuRD的互作是否有功能呢？作者对野生型以及PAC1突变T细胞中组蛋白的乙酰化水平进行了WB检测，发现PAC1缺失之后，组蛋白的乙酰化水平显著提高。这说明PAC1 的确促进了 NuRD 的去乙酰化功能（下图 D）。

1. PAC1缺失的确导致了NuRD复合物在GZMB基因上结合的减少，并导致GZMB启动子区的乙酰化水平得到恢复。这说明PAC1通过NuRD调控T细胞激活相关基因的乙酰化水平，从而调控T细胞功能。

由于组蛋白乙酰化水平会影响核小体构型及染色质开放程度，那么 PAC1 是否影响了染色质的开放程度呢？作者使用 ATAC-seq 绘制了染色质开放区域图谱：

2. 和预期的一致的是，大部分发现的开放染色质区域或ATAC峰位于启动子，内含子，和远端基因间区域（下图A）；

3. 对不同基因位点的开放性的整体分析发现，PAC1缺失增加了T细胞效应相关基因，包括GZMB的染色质开放程度（下图B，C）。

综合以上结果可以得出结论：

肿瘤组织浸润的T细胞被ROS-EGR1通路激活PAC1的表达，使T细胞逐渐失去效应能力，最终导致T细胞衰竭和抗肿瘤免疫功能减弱。在这个过程中，PAC1并没有利用其磷酸酶活性，而是通过其N端UBR定位到染色体上，招募NuRD复合物对T细胞激活相关基因进行去乙酰化，通过重塑效应T细胞的表观遗传抑制其表达，从而抑制T细胞的活性。

参考文献：Dan Lu, Liu, L., Sun, Y. et al.  The phosphatase PAC1 acts as a T ce ll suppressor and attenuates host antitumor immunity.  Nat Immunol    21,287–2    97 (2020). https://doi.org/10.1038/s41590-019-0577-9