研究背景和待解决的科学问题

组培是植物遗传转化和快速克隆繁殖的重要手段，根据再生途径可以分为器官发生途径（organogenesis ）和体胚发生途径（somatic embryogenesis），前者从原生质体发育为成熟的组织，后者通过使用生长素诱导胚胎发育。组培过程中诱导产生的无性系变异会被引入再生植株中，导致表型异常和再生能力的丧失。无性系变异也源于DNA甲基化改变的表观基因组变异，并引起的性状的缺陷。这种现象在非洲油棕榈树、玉米、水稻等多种植物中已有报道。在大豆中，只要外源激素水平足够高，体胚可以维持胚胎状态；一旦外源激素被去掉，体胚将恢复正常的组织分化，达到生理成熟、发芽到植物。但是这并不是无期限的，长时间培养的体胚最终将丧失转化为植物的能力，并且较老的细胞系中获得的植物表型也会有异常。这个过程中是否有表观基因组的变化，及其变化对表型乃至最终转化能力的丧失是否有贡献，目前还没有研究。

因此，本工作要回答的主要问题，就是在大豆体细胞胚胎发生、维持的整个周期内，DNA甲基化是如何变化的，这种变化是何种机制调控的，以及这种变化对基因表达、表型变化乃至转化能力丧失之间是否存在关联。

实验设计：

作者对大豆子叶诱导产生的体细胞胚胎进行了长达13年的培养，直至其丧失转化为植株的能力。并在关键的时间节点进行了样品采集，联合使用BS-seq、RNA-seq和sRNA-seq三种组学手段，以回答上述问题：

Auxin诱导时间

生物学意义

取样1

取样2

未诱导

对照

子叶

诱导1天

体细胞胚胎开始形成

子叶

诱导6周

体细胞胚胎稳定形成

球状胚组织

分化组织

诱导10周+4天

有丝分裂最活跃、转化率最高

球状胚组织

诱导6月

体细胞无性系变异最活跃时期

球状胚组织

诱导1年

培养1年

球状胚组织

分化组织

诱导8年

老细胞，失去转化为植株能力

球状胚组织

诱导13年

老细胞

球状胚组织

实验结果：

BS-seq结果表明，未诱导的样品中CG、CHG和CHH三种甲基化形式的水平分别为45.0%、25.8%和1.8%，CHH最低。在诱导后的所有样本中，三种DNA甲基化水平均有增加，表明体细胞胚胎发育过程中伴随着DNA甲基化的增加，但长期培养又呈下降趋势。并且CG和CHG甲基化水平相对较稳定，而CHH变化相对较大。因此作者认为在体细胞胚胎发生过程中CHH水平的升高是造成基因转录沉默的主要原因。

那么这些发生甲基化的CHH发生在基因组的哪些位置呢？从全局甲基化水平来看，随着组培时间的延长，全基因组的甲基化水平呈下降趋势，但CHH先上升后保持相对稳定（下图A-C）。对所有样品进行差异甲基化区域（DMR）分析，发现大部分差异甲基化的区域都呈现CG、CHG甲基化水平的下降（hyper->hypo）和CHH甲基化水平的升高（下图下）。这个结果暗示CHH在维持着基因组甲基化水平保持稳定。

作者对CHH的超甲基化在基因组中的分布进行了分析，结果表明CHH超甲基化在整个基因组中发生，TE富集区增加幅度最大，基因富集区略有增加（下图左）。对任意样品间差异甲基化区域（DMR）进行分析发现（下图右），差异甲基化同样主要发生在基因间区，启动子区也有一定富集。对这两个部分的DMR进行分析发现，它们同样大部分与TE重叠。说明差异甲基化主要发生在TE相关区域。

作者进一步将基因组分成了TE、UM（unmehtylated)、gbM（gene-body methylated)和TEM（TE-like Methylated)四个不同的类型，并分析其甲基化的状态。结果发现CHH的超基化大都在已发生部分CHH甲基化的TE区域，提高这些区域的甲基化程度，而并非在未甲基化的UM区域产生新的甲基化。

上述结果表明CHH DNA甲基化的增加与预先存在的非CG甲基化有关，并且发生在TE和TEM基因上。这个结果暗示CHH在维持着基因组甲基化水平保持稳定。

体细胞胚胎生成期间CHH的超甲基化是如何发生的？

植物中CHH的超甲基化是RdDM（RNA directed DNA methylation）通路和CMT2通路的组合效应。那么体胚形成期间CHH的甲基化变化RdDM和CMT2各自的贡献如何呢？

1)为了研究在胚胎诱导和体胚形成期间CHH甲基化变化是否是由于RdDM途径在起作用，作者使用RNA-seq数据分析了RdDM（包括经典RdDM和非经典RdDM）通路相关基因表达情况，发现经典RdDM相关基因表达量在体细胞胚胎中显著上调，同时非经典RdDM通路两个基因RDR6和DCL4表达量也增加。那么到底是经典RdDM还是非经典RdDM通路对CHH超甲基化起主要作用呢？由于经典RdDM通路受24nt siRNA调控，非经典RdDM通路受21/22 nt siRNA调控，因此作者做了sRNA测序，分析发现24-nt siRNA表达量远高于21/22-nt siRNA，且随着诱导表达量升高，与CHH甲基化水平上升趋势一致，因此作者认为经典RdDM通路是CHH超甲基化的原因。

2)RdDM通路CHH甲基化在TE边缘，而CMT2通路CHH甲基化在整个长TE。为了研究CMT2通路在胚胎诱导和体胚形成期间对CHH超甲基化的贡献，作者分析了CHH甲基化在4个TE家族（LINEs、LRs，TR和Helitron）中的分布特征：

a)CHH甲基化的增加均匀地发生在所有四个家族的边缘和body，同时这些相同的区域增加了24nt的小RNA，表明RdDM通路在起作用；

b)体胚生成阶段，CMT2 mRNA的水平没有增加；

c)CHH没有CMT2的三核苷酸偏好。

这些结果表明，RdDM通路可能是全基因组CHH超甲基化的主要驱动力，并且CMT2提供了支持作用。

上面的结果总结一下我们发现，连续的组培使得CG和CHG的甲基化水平降低，但CHH甲基化程度升高，以稳定全基因组甲基化水平的稳定。那么这种现象是长期组培（8年）后丧失转化能力的原因吗？哪些基因的甲基化和表达变化是产生上述表型的原因呢？

因此作者对组培过程中CHG甲基化水平升高和降低的基因的表达情况进行分析，发现存在数百个基因CHG甲基化的水平随着组培时间的延长逐渐降低，且在培养8年之后甲基化水平急剧降低。这些基因中的超过70%的基因表达水平则随着甲基化程度的降低而升高，说明这些沉默基因的重新激活与DNA甲基化的丧失高度相关。但是对这些基因进行GO富集分析没有发现任何重要的类别，因此甲基化的丢失和基因的激活很大程度上是一个随机事件。

这不能解释为什么长期组培使体胚丧失转化能力。因此作者选取了大豆中种子发育非常关键的75个基因进行了专门分析。结果表明，新生体胚的表达特征与合子胚和发芽种子最相似；培养1年内的体胚表达特征更接近种子发育过程中早期合子胚的表达特征；而长期培养的体胚表达特征与种子发育后期的合子胚有很强的相似性。这些结果表明，长期组织培养导致细胞命运的发育转变。

综合本文的所有结果我们可以发现，体胚的长期培养，的确导致发育相关基因的表达发生了变化，这些变化是长期培养的体胚无法转化为正常植株的原因所在。这些基因表达的变化也的确是由甲基化控制的，长期的培养导致全基因组范围内甲基化程度，尤其是CG和CHG的降低，从而导致基因组不稳定，基因表达出现紊乱。而RdDM介导的CHH的超甲基化稳定了基因组结构，但不能逆转基因表达的紊乱，因此体胚虽然可以继续长期培养下去，但失去了转化为植株的能力。