癌症是全球死亡率第二的疾病，靶向治疗则给癌症患者带来了福音。但靶向药的普遍问题在于，长期使用会产生耐药性。前期有大量的工作对耐药性的机制进行了研究，鉴定了大量的耐药相关突变，但这些突变的发生率很低、只能解释一小部分患者耐药的原因。大部分患者中不存在耐药突变，却产生了耐药性。本文就是从基因表达的层面，尝试揭示结直肠癌西妥昔单抗的耐药机制。
研究背景和待解决的科学问题
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是我国最常见的消化道恶性肿瘤之一，具有发病率高，病死率高，治愈率低等特点。CRC细胞表面会出现大量的表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR），而西妥昔单抗（cetuximab）是针对EGFR的靶向药物，它能特异性结合EGFR的胞外结构域，抑制EGFR与酪氨酸激酶的作用，阻断细胞内信号转导通路，从而抑制癌细胞增殖，诱导癌细胞凋亡。不幸的是，CRC患者经常产生西妥昔单抗耐药性，前期的工作已经鉴定出了很多耐药相关的基因突变，如KRAS, NRAS, BRAF, PIK3CA，以及EGFR本身的突变。但是这些突变仅能解释小部分患者耐药的原因，对于大部分患者耐药的原因，还需要更多的工作。因此，本工作的主要目的，是从基因突变之外的角度，来揭示耐药性产生的原因。作者选择了基因表达和ncRNA的角度来开展工作，本工作的主要目的，是来鉴别：
1）西妥昔单抗耐药性机制是否有ncRNA参与调控？如果有，是什么ncRNA？
2）如果有ncRNA，那么它是如何影响耐药性的？
3）如果有ncRNA，其上下游的分子分别是什么？
Q1：西妥昔单抗耐药性机制是否有ncRNA参与调控？如果有，是什么ncRNA？
为了回答上述问题，作者构建了敏感CRC囊性细胞（cystic colonies, CC）和耐药CC（cetuximab-resistant cystic colonies, CC-CR），并做了RNA-Seq和小RNA测序（Small RNA-seq），发现CC-CR与CC相比：
1）有141种转录本上调以及220种转录本下调，上调最显著的转录本是lncRNA MIR100HG；
2）有7种miRNA上调以及24种miRNA下调，其中上调最显著的miRNA是miR-125b和miR-100。
3）MIR100HG位于11号染色体，是miR-100，let-7a-2和miR-125b-1的宿主基因
4）qRT-PCR实验证实，无论是否存在西妥昔单抗，CC-CR中内源MIR100HG、miR-100和miR-125b的初级体和成熟体均显著上调
5）对TCGA中CRC的RNA-seq数据存的分析显示，miR-100和miR-125b表达与MIR100HG表达正相关。
上述结果表明，耐药细胞中的lncRNA MIR100HG显著上调并导致miRNA miR-100和miR-125b的显著上调，这2个miRNA可能与耐药有关。
Q2：如果有ncRNA，那么它是如何影响耐药性的？
既然发现了miR-100和miR-125b在耐药细胞中高表达，那么这种表达模式是否与耐药性相关呢？为了回答这个问题，作者在CC-CR中对这2个miRNA的表达进行干预，并观察对细胞的影响，发现：
1.在耐药细胞CC-CR中阻断miR-100后，西妥昔单抗会降低colony number；而阻断miR-125b或同时阻断2个miRNA，药物处理则会更显著的降低其colony number。
2. 在不耐药细胞CC中过表达miR-100或miR-125b单miRNA对其CC colony number没有影响，但双miRNA过表达增加其colony number。
3. 在不耐药细胞CC中同时过表达miR-100和miR-125，可以大大提高西妥昔单抗处理时细胞的生存率。
4. 细胞增殖标记Ki-67和细胞凋亡标记Capase-3断裂体染色实验结果与上述colony number计数的结果相符。
5. 将不同操作的CC-CR和CC移植到裸鼠皮下，并用西妥昔单抗处理时，也观察到相似的结果。
上述结果表明，miR-100和miR-125b过表达是否确实导致了耐药性。
Q3：如果有ncRNA，其上下游的分子分别是什么？
既然miR-100和miR-125b与耐药性正相关，那么：
1）miRNA是通过调控哪些下游基因的表达或者通路影响耐药性的？
2）miRNA表达受到哪些上游因素的调控？
作者进一步挖掘了RNA-Seq数据，发现与CC相比，CC-CR中Wnt信号通路的2个基因DKK1和DKK3的表达降低了30倍以上；miRNA靶标预测工具发现这2个基因的3'UTR分别包含了miR-100和miR-125b的结合位点。进一步预测发现除了这2个基因外，ZNRF3、RNF43和APC2这3个Wnt/β-catenin通路的基因也是miR-100和miR-125b的潜在调控目标。因此作者构建了荧光素酶报告系统，证实了这五个候选基因在CC细胞中是受到miR-100/miR-125b直接调控的。免疫印迹法也证实，上述基因的蛋白水平也受到这2个miRNA的调控。
那么miRNA对Wnt通路相关基因的调控，是否导致Wnt通路功能的变化呢？作者从多方面做了探索：
1)CC-CR中酪氨酸磷酸化的活性p-Y489 β-catenin大大增加；
2)CC-CR中Wnt通路下游靶基因的mRNA表达明显上调；
3)CC中过表达miRNA后，Wnt通路下游靶标基因表达被激活（双miRNA过表达> miR-125b > miR-100）；
4)裸鼠中移植物CC-CR耐药细胞后，使用西妥昔单抗处理只能减缓肿瘤的生长，而联合使用ICG-001（Wnt活性抑制剂）则能导致肿瘤消退。
上述结果表明，miR-100和miR-125b是通过对Wnt通路相关基因的调控，导致耐药性的产生的。
上面的结果表明，miR-100/125b通过调控Wnt通路导致耐药性的产生，那么这2个miRNA的表达又是受什么调控的，为什么在耐药细胞中表达被激活呢？为了回答这个问题，作者开始往上游研究。
由于lncRNA MIR100HG是miR-100和miR-125b的宿主基因，通过对MIR100HG启动子区进行转录因子预测，并结合RNA-Seq数中转录因子的表达情况，作者将注意力集中到了转录因子GATA6上----该基因在耐药细胞CC-CR中表达显著下调。
1)不耐药细胞CC进行药物处理后，MIR100HG表达降低，而GATA6逐渐升高；
2)不耐药细胞CC中敲低GATA6导致MIR100HG上调；
3)萤光素酶报告实验显示，MIR100HG启动子活性受抑制程度依赖于GATA6的过表达浓度；
4)通过Motif分析，在MIR100HG启动子区域确定了4个GATA结合位点（G / A）GATA（A / T），顺序删除和突变这些结合位点的实验结果表明，GATA结合位点2（TSS上游-1,198）是GATA6抑制MIR100HG转录活性的主要位点。
上述结果表明转录因子GATA6是MIR100HG的负调控因素，在耐药细胞中其表达的降低导致了MIR100H表达的激活，并导致miR-100/125b表达升高，进而导致耐药性的产生。那么，又是什么因素使得GATA6在耐药细胞中表达降低呢？
作者通过miRNA靶标预测，发现GATA6的3’UTR区也存在1个miR-125b的结合位点。
1)荧光素酶报告实验表明，CC细胞中过表达miR-125b能抑制含有GATA6的3’UTR的荧光素酶活性，对miR-125b结合位点进行突变则解除了这种抑制；；
2)不耐药的CC细胞中过表达miR-125b使得GATA6水平降低；而在耐药的CC-CR细胞中敲低miR-125b则会使GATA6水平降低；
3)TCGA数据库分析显示，在IV期CRC患者中，GATA6显著下调，而MIR100HG显著上调，且低表达GATA6的CRC患者往往高表达MIR100HG。
综上所述，这些发现表明，GATA6、MIR100HG和miR-125b之间的双向负调节回路是西妥昔单抗耐药的分子基础。
总结：
这是一篇典型的研究药物影响相关分子的范例。作者从RNA-Seq和Small RNA-seq数据着手，寻找最可能与药物作用相关的关键基因；找到目标基因之后，通过多种实验手段，确认了目标基因影响了药物作用；接着再回到RNA-Seq数据，结合生信预测，寻找到目标基因的上下游基因/通路；最后临床样品验证，结果能够支持临床前研究。在此过程中，RNA-Seq数据被反复深挖，得到了很多有用的信息。整体思路非常清晰，特别值得药物研究者借鉴。
参考文献：
Lu Y., Zhao X., Liu Q. et al. lncRNA MIR100HG-derived miR-100 and miR-125b mediate cetuximab resistance via Wnt/β-catenin signaling. Nat. Med. 2017, 13, 1331-1341.
