先天不足的司马睿南渡江东能站稳脚跟，王导、王敦兄弟出力最多，二人一文一武相得益彰。正是由于他们的忠心拥戴，才有了东晋的建立和这些北方流民偏安一时的可能。正如《晋书·列传第三十五·王导》所记载的那样：“由是吴会风靡，百姓归心焉。自此之后，渐相崇奉，君臣之礼始定。”
但是，“共天下”不是王与马平衡的、稳定的结合，它是一种以家族集团利益为基础的、长期发展起来的、相互为用的政治关系，是在一定的政治环境下出现，又依条件的变化而变化的政治现象。当一方认为有必要或有可能取代对方时，这种平衡关系就会被打破。因此随着时间的推移，当司马睿的地位逐渐稳定后，皇权与门阀共治的矛盾也开始凸显出来。为此，司马睿起用以刘隗、刁协为首的大量非王系名士，施行“以法御下”的“刻碎之政”来对抗强大的王氏家族。
王氏家族遭到排斥，王导当然的不满，但身处建康，也只能忍耐。但有大功于司马氏，又据上游之重，都督六州军事，手握重兵的王敦就不同了，他上疏司马睿为王导鸣冤叫屈，毫不掩饰地表达了怨恨之情。
王敦既素有重名，又有拥立之功，且专任外藩，“手控强兵，群从贵显，威权莫贰”【《晋书·列传第六十八·王敦》】，这使得刘隗、刁协认识到，欲加强皇权，仅仅实行“以法御下”是不够的，还必须削弱乃至剥夺门阀士族的兵权。于是刘隗以王敦威权过于强盛，终将难制为由，竭力劝说司马睿任用心腹出镇外藩，以收兵权。
从王敦来说，他也有顾忌。虽说王氏与司马睿之间的矛盾已经弄得朝野皆知，但要兵向建康，毕竟是事关身家性命的大事，非同小可，不到迫不得已，也是不能走那一步。而且从实际情况看，也不是一件容易的事。这是因为，尽管王敦坐镇武昌（今湖北鄂州），可以轻松顺流而下直趋建康，可是武昌北面的襄阳，驻扎着号称“中兴名将”的梁州刺史周访。不仅如此，还有岭南的陶侃，豫州的祖逖，这些都是王敦非常忌惮的人。
据《世说新语》记载，每次喝酒王敦总爱吟诵曹操的《龟虽寿》：“老骥伏枥，志在千里；烈士暮年，壮心不已。”边吟边用如意狠狠地击打唾壶，把唾壶边沿都打得坑坑洼洼的。王敦比司马睿大了整整十岁，面对复杂的朝局和北方沦陷的国土，内心应该是五味杂陈的。
太兴三年（公元320年）八月，六十一岁的周访因病去世，使事情出现了转机。周访一死，来自北面的威胁瞬间被化解。王敦命从事中郎郭舒北上襄阳，暂时监管襄阳的军队，这是王敦扩充自己实力的一个重要步骤。
司马睿自然不会坐视，不久他正式任命湘州刺史甘卓为梁州刺史、安南将军、假节，都沔北诸军，镇守襄阳，同时征召郭舒为尚书右丞。司马睿的目的：一是为了抢夺地盘，二是意在瓦解王敦阵营。
王敦当然的拒绝执行司马睿的命令，强行留下郭舒。而甘卓也并非忠纯之臣，再加年老多疑，襄阳方面不再让王敦感到担忧。
甘卓任梁州刺史，他原本的湘州刺史就空了出来。在王敦看来，既然甘卓接任了梁州刺史，那应该让他的人去做这个湘州刺史吧！因此他表荐亲信、吴地大族出身的宣城内史沈充任湘州刺史【注：《晋书·列传第六十八·王敦》载：“及湘州刺史甘卓迁梁州，敦欲以从事中郎陈颁代卓。”此从《晋书·列传第七·闵王承》】。
湘州（治临湘，今湖南长沙境）号称南楚险固，居长江上流之要，控荆、交、广三州交界处，是用武之国。控制湘州，对东晋朝廷来说，无异于在王敦势力范围内打入一个楔子 。因此，司马睿在刘隗、刁协等人的劝告下，未理会王敦的表荐，于当年十二月，诏命自己的从叔父、左军将军、谯王司马承为监湘州诸军事、南中郎将、湘州刺史。
司马承忠有余而才不足，再加湘州经动乱后荒残困弊，故而王敦虽心怀不满，但也没有太大异议，既不给湘州增调戍卒，也不调拨军资供应。
司马承上任以后厉行节俭，十分称职，王敦担心会对自己不利，假称将要北伐，征召湘州境内所有的船只。司马承明白王敦的用意，只送去了一半。
安排谯王司马承做湘州刺史，是司马睿瓦解王敦的第一步。王敦觉察到朝廷不信任自己，就上表要求将部属在扬州的家眷接到荆州。其用意有二：一是如朝廷同意这一要求，则可收买人心，并可以防备来自建康的不虞；二是如朝廷拒绝，则可因此煽动将士对朝廷不满，为起兵提供借口。
这道表章理所当然地被朝廷拒绝。
第二年即太兴四年（公元321年）五月，也就是石勒刚刚攻下厌次（今山东惠民东）、俘获段匹磾、平定河北后的一个月，司马睿下诏，将从中原流落到扬州各郡为奴的流民，全部免除奴客身份，征召为兵，并取将吏的奴客负责运输粮草。
司马睿之所以这样做，也是无奈之举。当时，北来流民依附于高门大族，数量极多。正如应詹奏疏所称：“下及工商流寓僮仆不亲农桑而游食者，以十万计。”【《晋书·志第十六·食货》】而在当时的军户制下，军户又多由门阀世族所把持，这不仅使得中央朝廷的兵源严重短缺，而且也造成了政府税收的锐减。《文献通考·卷一五一·兵考三》也称：“元帝南渡……然调兵不出三吴，大发毋过三万。”相反，此时的王敦身为侍中，大将军，都督江、扬、荆、湘、交、广六州诸军事，力量十分强大，形成了“枝强干弱”的局面。为了以防万一，司马睿采纳了刘隗、刁协的意见，征发高门大族的奴客为兵。
与之相配合，司马睿又颁布了占田荫客令，大幅度削减一、二品官员的奴仆田客数量，相应地增加三品以下官员奴仆田客的数量，具体规定：一、二品官可占佃客四十户，每低一品减少五户，而佃客按一定比例向主人交纳实物地租，不负担国家课役，佃客不自立户籍，他们的名数纳入主人的户籍中。这一举措，直接侵害了高门大族的利益，不过也没有拉拢住低级官吏。因为东晋的户籍制度本就不十分严格，官吏在规定的限额以外偷偷占有佃客的事情屡见不鲜。
紧接着七月，司马睿拜尚书仆射戴渊为征西将军，都督兖、豫、司、冀、雍、并六州诸军事，假节，司州刺史，加散骑常侍，镇合肥；以丹杨尹刘隗为镇北将军，都督徐、青、幽、平四州诸军事，青州刺史，镇守淮阴（今江苏淮安）【《晋书·列传第三十九·刘隗》记为泗口，此从《晋书·帝纪第六·元帝》】。司马睿对二人寄予厚望，临出发时，亲自到军营里为二人践行，犒劳将士，赋诗励志。
司马睿将刘隗、戴渊二人调外任，名义上是防备北方石勒，实则是防备王敦。因而刘隗出任外藩后，仍遥控朝政，凡是朝廷重要事务，如选举用人等，司马睿都要与他密谋后才作出决定。王敦对此心知肚明，极为不满，他意带威胁与利诱双关的给刘隗写了一封信，信中说：
顷承圣上顾眄足下，今大贼（北方胡族）未灭，中原鼎沸，欲与足下周生之徒戮力王室，共静海内。若其泰也，则帝祚于是乎隆；若其否也，则天下永无望矣【《晋书·列传第三十九·刘隗》】。
意思是说：承蒙近来陛下非常信任赏识你，如今中原动乱、胡贼未灭，我想与你和周顗等人齐心协力，辅佐王室，以安天下。如果我们之间可以泰然相处，则国运可以历久不衰；反之，天下将永无安定之日。
刘隗根本不理睬王敦递来的“橄榄枝”。他引用《庄子·内篇·大宗师第六》中“鱼相忘于江湖（鱼儿一到大海，就相互忘掉了对方），人相忘于道术（人有了一些本事，就相互忘掉了彼此）”作为答复，表示人各有志，不必强求一致非有来往不可。又引用春秋时，晋国大夫荀息所说的“竭股肱之力，效之以忠贞”【《左传·僖公九年》】，表明自己的志向，含蓄地指斥王敦怀有不臣之心，拒绝了王敦的拉拢。
王敦得书后，对刘隗加倍怨恨。更让他恼怒的是，司马睿又夺了王导骠骑将军的官职，加封其为侍中、司空、假节、录尚书事、领中书监，以虚衔驾空王导。
王敦再次上疏，向司马睿陈述自古以来忠臣被皇帝猜忌，而小人从中煽风点火离间之事，想要以此感动司马睿。然而，这已经不是忠臣不忠臣的问题，而是皇权与相权之间不可调和的矛盾的问题，仅凭一纸奏疏，已不能化解这一切。王氏不放弃权力，对于司马睿而言，一切都是空话。王敦所说的不仅不能感动司马睿，相反让司马睿更加感到威胁。
为了安抚王敦，司马睿加王敦“羽葆、鼓吹，增从事中郎、掾属、舍人各二人”【《晋书·列传第六十八·王敦》】。所谓“羽褒”，指帝王仪仗中以鸟羽联缀为饰的华盖，亦泛指卤簿或作为天子的代称。《汉书·赵尹韩张两王传》载：“建幢棨（qǐ），植羽葆。” 颜师古注曰：“羽葆，聚翟尾为之，亦今纛（dào）之类也。”《晋书·载记第七·石季龙下》也说：“因而游猎，乘大辂，羽葆，华盖，建天子旌旗。”司马睿的恩宠不可谓不厚，但是这些表面文章，王敦又怎能买账。
祖逖·中流击楫
同年九月，镇西将军祖逖病死于雍丘（今河南杞县）。司马睿追赠祖逖为车骑将军，并以祖逖的同母弟祖约为平西将军、豫州刺史，代领祖逖之众。王敦对周访、祖逖颇为忌惮，二人先后病故，王敦再无什么顾忌，最终决定起兵。
东晋建立后，粮食供应主要仰仗三吴，如果控制了三吴地区，将起到釜底抽薪之效。因此，王敦一方面利用司马睿征召奴客为兵后，在扬州地区士族地主中对朝廷存在的不满情绪，派遣参军、吴兴（今浙江湖州）人沈充回到扬州，纠合反对朝廷的势力；另一方面在荆州集结军队，加强战备，筹划起兵。
