编者按

归功于预防性乙肝疫苗研发和接种策略的完善，HBV感染及传播的预防已取得了巨大的成就，越来越多的新生儿以及高危人群从中获益。近年来，作为一种新兴的慢性乙型肝炎（CHB）治疗战略，国内外针对CHB治疗性疫苗的开发与探索脚步一直未能停歇。本刊特邀请桂林市第三人民医院程书权教授撰文，为广大同道介绍当前乙肝治疗性乙肝疫苗研究进展。

治疗性疫苗是通过特定的抗原，刺激人体免疫系统产生具有特异性的抗体或免疫活性细胞，从而改变机体的免疫状态，使其能够抵御疾病引起的病变的药物。人们希冀通过运用这种特殊疫苗，实现对CHB更加有效的治疗，这也一直以来都是医学界孜孜不倦的迫切追求目标。

乙肝治疗性疫苗的研发理念，是通过打破免疫耐受或增强HBV特异性T细胞功能，激活与增强人体自身的免疫反应，达到清除CHB患者体内HBV，从而实现CHB真正治愈的目的。对CHB患者而言，由于HBV抗原长期、持续地暴露于免疫系统，经此过程HBV的天然抗原被免疫系统误认为是内源性的，因此只保留了很弱的免疫原性，故预防性乙肝疫苗的经验已不适合用于治疗性疫苗的研发。

1986年，我国复旦大学医学院闻玉梅院士在全球率先提出了“乙肝治疗性疫苗”的理念，并于1995年于《柳叶刀》杂志发表论文，正式形成了“乙肝治疗性疫苗”概念，疫苗的治疗作用也由此形成并逐渐引起国内外研究者的关注。2009年，闻院士主持开发的全球首款治疗性疫苗Ⅱ期研究数据非常完美，可惜Ⅲ期研究临床结果未达预期，该疫苗未在临床推广应用。即便如此，她的开创性工作也为病毒免疫学的发展和CHB治疗打开了一扇新的大门。

历经此后的近30年至今，目前对乙肝治疗性疫苗的研究已经有了许多开创性的新方法和新进展，且在动物实验及体外细胞实验中都表现出非凡的效果，相信正式打破临床应用瓶颈的“临门一脚”已为期不远。理论上，相应的设计对消除HBsAg也的确应该有效，且国内外已披露了多种研发药物，由于真正达到药品级的商用者很少，故多数品种无规范的名称，仅以研发代号表示。本文就近年在研的最具前景的几个品种介绍如下。

总体而言，基于对形成慢性HBV感染的免疫机制的认识不断深化，一些新型的策略被用来增强患者的HBV特异性免疫反应。一方面，口服、鼻内或皮下应用病原体识别受体（PRRs）激动剂，包括Toll样受体（TLR）、维甲酸诱导基因1（RIG-I）和干扰素基因（STING）的刺激剂，激活宿主免疫细胞和肝细胞/非肝细胞，诱导干扰素（IFN）的产生以及干扰素刺激基因（ISG）和促炎症细胞因子的表达，启动细胞的抗病毒状态；另一方面，用治疗性疫苗诱导 HBV 特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），通过阻断免疫检查点作用来增强T细胞功能，或转移体外激活的Ｔ细胞或NKT细胞或基因编辑的HBV特异性T细胞，如：嵌合抗原受体（CAR）或T细胞受体（TCR）-T细胞加强细胞免疫。在过去几年间，这些策略的潜在应用价值已得到部分证实，但这些方法投入临床应用仍有许多障碍有待克服。

01

HBsAg/HBcAg 复合疫苗

为主要由HBsAg和HBcAg组成的治疗性疫苗，在野生型C57BL/6小鼠和HBV转基因动物模型中能够引起强烈的针对 HBsAg/HBcAg 特异性体液反应，促进针对HBsAg的Th1/Th2平衡反应，以及针对HBcAg的Th1型反应；增强的HBsAg/HBcAg特异性细胞免疫反应导致HBV 转基因小鼠中的血清HBsAg水平明显降低，但未出现肝脏损伤。由HBsAg、HBcAg和佐剂ISCOMATRIXTM组成的微粒疫苗可以在HBV转基因小鼠中诱导多特异性和多功能T细胞，特别是针对 HBcAg的特异性CD8+T细胞，使其IFN-γ、TNF-α和IL-2的分泌量升高；4次疫苗接种后，8只动物中7只抗-HBs滴度超过10000 mlU/mL；接种2次和4次疫苗后，HBV转基因小鼠血清中HBV DNA滴度下降，但没有达到统计学意义；HBcAg阳性的肝细胞也急剧减少，但没有出现明显的肝损伤。

02

基于病毒载体的疫苗

国外有人在小鼠和土拨鼠 HBV感染模型中测试了基于腺病毒载体的治疗性疫苗，获得了较好的抗病毒效果，通过滴鼻或肌肉注射表达MHB的高度减毒的VSV株，成功诱导了针对MHB 特异性CD8+T细胞和体液反应，免疫后在小鼠模型中能够防止基于腺相关病毒载体重组HBV基因组（AAV-HBV）转导后启动的HBV复制。在HBV持续复制的小鼠模型中，VSV-MHB系统也能诱导明显的多特异性T细胞反应，导致血清和肝脏HBV抗原和DNA水平下降，同时ALT活性也有短暂的升高。这些实验数据为基于病毒载体的治疗性疫苗的潜在效用提供了证据。

03

TherVacB

TherVacB是由德国研发的以DNA为基础的治疗性疫苗，采用重组HBsAg和HBcAg两种蛋白免疫和表达HBV抗原的改良痘苗病毒安卡拉载体（MVA）加强免疫策略，旨在激活乙型肝炎病毒特异性B细胞和T细胞反应。在HBV小鼠模型中显示，可诱导高效价抗-HBs、细胞毒性T细胞和对HBV的长期控制，HBV小鼠接种TherVac B后产生强烈的特异性抗体和CD8+T细胞应答，其HBsAg和肝内HBV DNA在ALT活性短暂、中度增加后下降，HBeAg阴性小鼠的肝内HBV特异性CD8+T细胞表达更多IFN-γ，提示TherVac B对HBeAg阴性HBV携带者T细胞功能的增强作用要高于HBeAg阳性携带者。在HBV持续复制的小鼠模型中，小干扰RNA联合TherVac B可干扰PD-1与PDL-1间的相互作用，增强HBV特异性CD8+T细胞的功能，在外周血和肝脏中都能表现出更长久的抗病毒作用，表明小干扰RNA联合TherVac B靶向PD-L1能够增强治疗性疫苗的功效并成为最终治愈CHB有前景的治疗策略之一。其Ⅰa期临床试验已正式启动。

04

LNP-mRNA疫苗

新近报道，中国药科大学与山东大学联合开发了一种用于CHB治疗的LNP-mRNA疫苗，通过编码HBsAg并借助人工智能算法，设计了具有最佳折叠稳定性和密码子使用的信使核糖核酸（mRNA），使得该疫苗兼具强免疫原性和持续病毒抑制作用的优越性。

研究者以每周肌内注射三针5 μg或10 μg的mRNA疫苗，显示小鼠可表现出血清HBsAg的快速下降。在3剂给药完毕后1周甚至已检测不到血清HBsAg。在此基础上，在3针后第59天时，5 μg和10 μg组的抗-HBs滴度分别达3624.0 mIU/mL和4804.6 mIU/mL。小鼠在第60天重新注射pAAV-HBV2.1质粒模拟病毒攻击，PBS小鼠仍然表现出高水平的血清HBsAg，而所有疫苗组小鼠的血清HBsAg水平都没有达到可检测水平并伴随有进一步升高的抗-HBs滴度，证明此疫苗接种后可在一定时期内持续保护小鼠免受病毒再暴露。此外，肝内HBVcccDNA、总DNA、总RNA和血清HBV DNA在接种疫苗的小鼠中亦明显降低，肝组织中HBcAg的表达大幅降低。将mRNA疫苗的疗效与恩替卡韦（ETV）进行并列比较发现，ETV无诱导抗-HBs或消除血清HBsAg的能力，仅能降低血清HBV DNA的拷贝水平。研究人员认为，mRNA疫苗的潜在免疫机制可为通过非细胞毒性而消除病毒，初免后的小鼠树突状细胞（DC）亚群和浸润到脾脏的巨噬细胞增加，并伴有有效的细胞成熟，三剂mRNA疫苗即可诱导出Th1偏倚的CD4和CD8 T细胞的强劲水平，产生有利于病毒消除的IFN-γ或IL-2。此外，接种疫苗后，脾脏中HBsAg特异性记忆B细胞（MBCs）的频率亦明显升高。由于针对HBV的细胞毒性和非细胞毒性免疫反应在消除HBV中均很重要，因此mRNA疫苗的进一步开发值得关注。

05

CLB-3000

CLB-3000是一款旨在实现CHB功能性治愈的治疗性乙肝疫苗，由两种从巴斯德毕赤酵母中纯化的HBsAg改良性CLB-405和CLB-505组成，用氢氧化铝为佐剂。在2023年墨西哥举办的 Hep-DART大会上，研究人员披露了在持续性HBV感染的小鼠模型中进行的CLB-3000临床前疗效鉴定，已进行慢乙肝人体临床试验注册登记，且正在招募受试者。

在持续HBV感染的小鼠模型中进行的CLB-3000临床前疗效鉴定结果显示，小鼠接种 CLB-3000 治疗性疫苗后，血清 HBsAg 降至检测不到的水平，肝脏免疫组织化学（IHC）证实了这一点。在接受过CLB-3000治疗并达到功能性治愈的慢乙肝小鼠中，有80%的小鼠同时检测到了清除情况相关的抗-HBs反应，其相关表位抗体特异性靶向HBsAg的外环1和2，与功能性治愈患者中观察到的抗体特异性相似。还检测到了 CLB-3000 特异性抗体反应。

研究认为，CLB-3000在小鼠慢性乙型肝炎模型中具有很高的疗效，表现为HBsAg快速下降并从血清和肝脏中清除，同时血清转化为清除情况相关的抗-HBs，与临床功能性治愈的相关抗-HBs一致。动物对重复注射的耐受性良好，最高剂量为500 µg总抗原。

06

YFV-HBc PLLAV

目前，YFV疫苗可诱导长效体液反应和强大的细胞免疫原性，被认为是迄今最有效的剂型之一。AstriVax正在开发一种适用于预防和治疗HBV的双效疫苗平台技术，该技术基于质粒启动减毒活疫苗（PLLAV）包括黄病毒，如可携带外来抗原的黄热病病毒（YFV）17D 疫苗株。凭借平台的治疗潜力，AstriVax开始开发一种有潜力的最佳抗HBV感染疫苗，在CHB中，诱导有效而持久的CD8+T细胞应答被认为是消除受感染肝细胞的关键，目前该疫苗处于临床前研究阶段。HBV核心（HBc）被用作模型抗原插入编码YFV 17D的多聚蛋白中。研究人员在允许 YFV 复制的小鼠模型中，对这种重组减毒活疫苗（LAV）诱导针对HBc的细胞免疫反应的能力进行了临床前评估。研究人员在AAV-HBV转导的C57BL/6小鼠中，通过采用过继转移和使用TLR9激动剂调节肝脏微环境的方法，初步评估了诱导的HBc特异性T细胞对病毒参数的影响。

结果显示，单次注射YFV-HBc PLLAV可诱导未感染的小鼠产生YFV 和HBc特异性T细胞反应。同样，用PLLAV衍生的YFV-HBc LAV进行免疫，在YFV和HBc抗原肽的刺激下，可检测到数量相当的IFN-γ斑点形成细胞。与仅接种YFV-HBc LAV相比，接种HBc蛋白原液佐剂 15天后再接种YFV-HBc LAV会增加分泌IFN-γ的HBc特异性T细胞数量。然后用分离的脾脏细胞对已建立AAV-HBV感染和基线高HBsAg（>4 logIU/mL）的C57BL/6小鼠进行被动免疫，结果血清HBsAg显著下降，一过性ALT升高，与TLR9激动剂联合使用时转导的HBc阳性肝细胞减少。

研究发现，携带HBc抗原的YFV PLLAV可在允许YFV复制的小鼠模型中诱导针对HBc的强大T细胞反应。此外，研究还证明，尽管基线HBsAg水平较高，但异源原代增殖产生的T细胞的过继转移可导致HBV持续下降。这些令人鼓舞的早期疗效数据证明了YFV接种疫苗在诱导强大而有效的T细胞应答方面的潜力，因此未来有必要进一步在人体研究中将其作为CHB治疗方案的一部分进行评估。

总之，治疗性疫苗的研究与开发，目前已成为国内外学术界的热点之一。虽然多年来HBV治疗性疫苗的设计和有效性已逐步得到了进步，在各种实验环境中，这些候选疫苗可刺激HBV特异性T细胞，并达到不同程度的HBV抑制，而且许多药物，在改善某一免疫功能指标方面令人耳目一新或貌似曙光乍现，但总体疗效仍然为束缚临床广泛应用的最大瓶颈，期待新的创新性理论和研究方法方面出现新的突破。

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