蛋白酶K（Proteinase K）是一种碱性丝氨酸蛋白酶，Wolfgang Ebeling等于1974年在林伯氏白色念球菌的培养基中分离纯化出来。因合成该种蛋白酶的微生物能在以角蛋白（Keratin）作为唯一碳源和氮源的环境中生长，因此被命名为“蛋白酶K ”。

蛋白酶K

1蛋白酶K的结构

蛋白酶K的氨基酸序列以及三维空间结构与丝氨酸蛋白酶家族的枯草杆菌蛋白酶极其相似，但是也有不同之处：

01含有二硫键结构，该结构使得蛋白酶K的稳定性变得更高。

02含有两个Ca2+结合位点。虽然Ca2+结合位点距活性位点较远，但经研究发现，Ca2+的去除会导致蛋白酶K失去80%左右的活力；重新引入Ca2+后，活性只能得到部分恢复。

得益于蛋白酶K结构中含有的二硫键和Ca2+结合位点，使蛋白酶K在高温环境和广泛pH条件下都仍能保持活性，且稳定性优异。

2蛋白酶K的性能

蛋白酶K具有催化三联体Asp-His69-Ser224特征，水解活性较高，反应底物特异性较为广泛，能够优先水解与芳香族氨基酸C末端、含硫氨基酸、疏水性氨基酸邻接的酯键和肽键，可将蛋白质水解成短肽。

3蛋白酶K的国家标准

中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局、中国国家标准化管理委员会于2017年11月发布了《蛋白酶K》（GB/T 34793-2017），该标准于2018年5月1日正式实施，规定了蛋白酶K产品的术语和定义、技术要求、试验方法、检验规则、标志、包装、运输及贮存等相关要求，适用于生化试剂蛋白酶K产品的生产和检测。

4蛋白酶K的应用

01核酸提取

核酸在细胞中往往是与蛋白质相结合，因此核酸提取时需要将核酸与蛋白质等物质进行分离，以便保证提取核酸的纯度。

蛋白酶K因其优异的蛋白降解能力，一方面可以有效降解与核酸结合的蛋白质，释放核酸，另一方面可以抑制核酸酶的活性，降低核酸酶在核酸提取过程中对核酸的降解。比如，在RNA提取过程中，普遍存在于环境中的RNA酶及样本体系自身的RNA酶极易导致RNA被降解，不利于RNA的提取。因此，可以考虑加入少量蛋白酶K，抑制RNA酶活性。

此外，由于蛋白酶K具有较高稳定性，在高温、尿素、EDTA、SDS等其他试剂存在的条件下仍能保持较高活性，在核酸提取中具有广泛且稳定的应用。

***核酸提取实验中蛋白酶K的工作浓度一般为0.05-0.2mg/mL，通常情况下，提取一个样本大约需要0.1mg的蛋白酶K。此外，在实际实验过程中，为了增加核酸提取效率，通常会提高蛋白酶K的用量。

02原位杂交

利用蛋白酶K的强降解作用对杂交前的标本进行处理，以将包围靶DNA的蛋白质降解去除，从而方便检测探针的穿透，提升检测敏感性。

***需控制好蛋白酶K的浓度及处理时间：过度处理会破坏细胞结构，导致细胞核消失或脱片；处理不充分则不能使靶核酸完全暴露。

03生物检测

利用蛋白酶K对水解底物的选择性进行某些蛋白的检测。

如传染性海绵状脑病的病原体是一种蛋白质，该蛋白质在正常情况下可被蛋白酶K完全降解，且在哺乳动物细胞内没有致病性；而当蛋白质结构发生改变时，会转化为病变型朊病毒，此时蛋白酶K只能将其部分降解。因此可以通过蛋白酶K鉴别是否患有朊病毒蛋白。

04工业及生活污水的病毒灭活

病毒外层结构一般以衣壳蛋白为主，蛋白酶K因其蛋白水解能力可以破坏病毒表面的蛋白。有研究表明，用浓度为67.51ug/mL的蛋白酶K对纯水和生活污水进行处理，处理1h的病毒灭活率分别为99.4％和49.4％，处理3h的病毒灭活率分别为>99.9％和81.8％。

蛋白酶K作为病毒灭活消毒剂，可以减少目前常规氧化性化学消毒剂对人体造成的潜在危害，并且生产与运输安全，无不可逆的环境污染。

05纺织领域

由于蛋白酶K对角蛋白的高效、特异降解作用，且相比其他蛋白酶，降解蛋白质的作用强、效率快，因此在羊毛剥鳞领域具有巨大潜力，是生物酶羊毛剥鳞技术的重点研究对象。

06其他应用

肉类嫩化、测定酶在细胞膜上的定位等。

5蛋白酶K的工业生产挑战

01表达量低

蛋白酶K可以非特异性的降解大多数蛋白，因此会对表达宿主中的有功能的蛋白进行水解，造成表达宿主不能持续的表达该蛋白，因此表达量偏低。

02稳定性差

蛋白酶K因其自我酶解特性，在无保护剂时很难长期稳定保存于37℃条件下。

03易沉淀

在制备蛋白酶K冻干粉时，需要加入冻干保护剂以维持较大的固含量水平。然而蛋白酶K在浓度达到20mg/mL或者以上时，容易聚集形成沉淀，这对高固含量冻干是很大的挑战。

04生产成本高

一方面，大规模发酵时的色素与宿主核酸残留去除会加大纯化工艺的复杂性和难度，降低回收率且增大生产成本；

另一方面，蛋白酶K的强蛋白水解活性，能够将实验室或车间使用到的其它酶或蛋白水解，所以最好安排专门的产地、仪器设备及配套设施。