近日，传染病重症诊治全国重点实验室李兰娟院士、曹红翠教授团队在Pharmacological Research（JCR Q1）发表了题为“A novel HIF2A mutation causes dyslipidemia and promotes hepatic lipid accumulation”的文章。该论文由李兰娟院士技术指导，传染病重症诊治全国重点实验室曹红翠教授、俞炯副主任技师和美国国立卫生研究院Zhengping Zhuang教授为共同通讯作者，课题组在读博士生高飞琼和姚奇谷作为共同第一作者。《国际肝病》特邀团队介绍研究过程及重要发现。
研究背景
肝脏疾病已成为全球头号杀手。随着饮食及运动习惯的改变，非酒精性脂肪肝（NAFLD）全球发病率越来越高，尤其在发达国家。肝脏疾病可能由家族性种系遗传突变或散发性体细胞突变或其他原因（环境因素或暴露）引起。缺氧会影响人体多种疾病，包括红细胞增多症、肿瘤、代谢综合征。缺氧诱导因子（HIF）在缺氧的过程中发挥着十分重要的作用。HIF由α亚基（HIF-1α、HIF-2α、HIF-3α）和β亚基二聚体化组成。已有一些研究报道了HIF-2α的氧依赖性结构域（ODD）上的突变与肝癌、Pacak-Zhuang综合征的发生相关。我们在HIF-2α的C端反式激活结构域（CTAD）区发现了一个未被报道过的突变，位于该结构域的突变被研究的较少。
研究发现
01
血脂异常患者HIF-2A上存在一种未被报道过的体细胞突变
我们通过对356名具有肝移植或者肝部分切除术指征的肝病患者的肝脏组织进行测序，发现了HIF-2α的CTAD上一个新的点突变（c.C2473T，p.R825S）。通过对不同物种的多肽序列进行对比，我们发现该位点在不同物种间高度保守。对收集的患者信息进行分析后，我们发现这5名携带突变的患者都存在一定程度的血脂异常。
图1. Sanger测序和多肽序列
（引自发表文章）
02
HIF-2α突变导致小鼠体重增加及NAFLD的发生
我们构建了HIF-2α突变的小鼠，分别给予高脂饮食（HFD）和标准饮食（SCD）喂养。与野生型（WT）小鼠相比，突变会导致小鼠体重增加，且高脂饮食能加大两组小鼠间的体重差异。同时，突变小鼠的肝脏重量较WT鼠大。通过H&E及油红染色，我们发现SCD喂养的突变小鼠肝脏中出现脂质的沉积，HFD喂养的突变小鼠肝脏中出现了明显的气球样变性。我们分别从突变及野生型小鼠肝脏中提取出小鼠肝脏原代细胞，并分别培养至添加了游离脂肪酸和牛血清白蛋白（对照）的培养基中，发现突变促进了小鼠肝脏原代细胞中脂质的沉积。
图2. 突变导致小鼠出现脂肪肝和体重增加
（引自发表文章）
03
HIF-2α突变与小鼠肝脏脂质代谢相关
取野生型及突变型小鼠肝脏组织进行脂质代谢组学分析。突变小鼠的肝脏相比野生型小鼠含有更多的脂质代谢物，包括甘油三脂（TG）、甘油酯、脂肪酰和甾醇。其中，TG是两组之间差异最大的脂质类别。KEGG富集分析显示，突变组和野生组之间存在脂质代谢相关途径的差异。有趣的是，喂食HFD的突变和WT小鼠之间的脂质代谢物差异不如喂食SCD两组小鼠之间的差异显著，进一步证实了突变本身可以影响脂质代谢。
图3. HIF-2α突变与小鼠的脂质代谢相关
（引自发表文章）
04
HIF-2α突变可增加体内和体外的脂肪酸转运合成和脂质水平
与WT小鼠相比，HIF-2α突变小鼠肝脏中脂肪酸转运、合成相关基因（Cidea、Cd36、Fabp2、Fabp3）的mRNA水平上升。同时，小鼠的血清和肝脏脂质水平也受到突变的影响。HFD喂养12周后，HIF-2α突变小鼠的血清胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平高于WT小鼠；突变小鼠肝内TG和TC显著升高。HIF-2α突变小鼠原代肝细胞中，TG、TC沉积增多，且负责脂肪酸转运和合成代谢的相关基因表达增加。
图4. HIF-2α突变影响脂肪酸的转运合成以及脂质水平
（引自发表文章）
05
携带HIF-2α突变的细胞系脂质沉积增加
我们构建了野生型HIF-2α和突变型HIF-2α慢病毒，将慢病毒分别转染到LO2和HEK293细胞。通过细胞生化测定及油红染色，我们发现与未引入突变的细胞相比，引入突变的LO2和HEK293细胞中的脂质沉积增多。
图5. HIF-2α突变细胞系构建；突变导致细胞内脂质增多
（引自发表文章）
06
突变增加了细胞核内HIF-2α蛋白量
突变和WT小鼠之间HIF-2α的mRNA和蛋白水平没有显著差异，但突变小鼠肝脏细胞核内HIF-2α的蛋白量增加。突变和WT小鼠原代肝细胞中HIF-2α的mRNA和蛋白水平没有显著差异，但HIF-2α的靶基因的表达在突变细胞中显著上调，且HIF-2α突变原代肝细胞中核内HIF-2α蛋白量增加。此外，我们发现携带突变的HEK293细胞较未携带突变的细胞具有更高的核HIF-2α蛋白水平。突变小鼠的肝脏中HIF-2α和HIF-1β结合增多。
图6. 突变增加了细胞核内HIF-2α的蛋白量
（引自发表文章）
07
PLIN2保护HIF-2α突变组中的脂滴免受脂肪吞噬
通过对小鼠肝组织进行转录组测序和基因富集分析，我们发现过氧化物酶体增殖物激活受体信号通路在突变组中呈上调趋势。随后我们发现该通路上的PLIN2基因的mRNA和蛋白水平在突变组中上调，伴随自噬相关基因下调。当PLIN2的表达被小干扰RNA抑制时，自噬相关基因的表达增加，细胞中脂滴沉积减少。PLIN2在临床样本中的验证结果表明携带HIF-2α突变的两名患者的PLIN2蛋白水平高于未携带突变的对照患者。
图7. PLIN2在突变体中保护脂质免遭脂肪吞噬
（引自发表文章）
研究者说
我们发现了HIF-2α上CTAD区一个未被报道过的突变，并证明了携带该突变更有可能出现血脂异常和NAFLD。该发现为开发靶向治疗由该突变引起的疾病的治疗方案提供了新思路，识别HIF-2α突变患者亚群有助于开发个性化疗法。此外，该研究为更好地探究NAFLD的机制提供了一种新型的NAFLD小鼠模型。
专家简介
曹红翠
浙大附一院 教授 主任技师 博士生导师
浙江大学 传染病重症诊治全国重点实验室副主任
浙江省增龄与理化损伤性疾病诊治研究重点实验室副主任
中国解剖学会干细胞转化医学分会主任委员
全国肝衰竭与人工肝专家委员会委员
中国生命关怀协会精准医疗与细胞治疗专业委员会常务委员
浙江省医学会感染病学分会常务委员
Journal of Internal Medicine编委
World Journal of Stem Cells 编委
《中华传染病杂志》编委
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来源：《国际肝病》编辑部
